高分辨熔解曲線分析技高分辨熔解曲線分析技術(shù)，highresolutionmeltingHRM，是近幾年來在國內(nèi)外興起的一種用于突變掃描和分型的遺傳學(xué)分析方法。它是一PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、分型等分析。 可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光 與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄高分辨率熔解曲線，從而對樣實驗前準備氏的LightCycler?480ControlKit和HighResolutionMeltingMaster等。HighResolutionMeltingMaster中含有2×MasterMix(包含熱啟動TaqDNAPolymerase反應(yīng)緩沖液，dNTPmix，高分辨率 的LightCycler?480，還有常規(guī)的離心機、水浴鍋等HRM體系配DNA樣品為例展開實驗。在1管中加入4μlMgCl2，再加入16μl水。同樣地，在2管中加入5.3μlMgCl2 配制好反應(yīng)體系后，各吸取20μl于96孔板中，設(shè)置3個重復(fù)。上樣完畢，蓋上蓋板膜，確保其密封性。將96LightCycler?480HRMQPCR程序設(shè)置退火65°C10s，延伸72°C20s并收集熒光。設(shè)置溶解曲線，各參數(shù)如屏幕所示。設(shè)置完畢后，即可點擊保存，并開始PCR反應(yīng)。樣品編輯SampleEditor進入樣品Scanning相同的樣品孔，MakeReplicates設(shè)為復(fù)孔。按照此方法根據(jù)實際情況編結(jié)果分析GeneScanning，Subset選擇需要分析的子集，按確認，進入HRM數(shù)據(jù)Negatives界面中曲線表示出了樣品的所在，通常不需要在這Normalization界面中，進行均一化處理熔解前和熔解后的曲線。Pre-meltSliderPost-meltSlider的溫度范圍，控制在橫向均一化曲線。Threshold的值0-5%的范圍內(nèi)，即可達到理想效果。在DifferencePlotCalculateHRM分型的結(jié)果。軟件會根據(jù)標準品的曲線形狀，將待測樣品的分型結(jié)果自動歸到相應(yīng)的型中，用不同顏通過分型圖，可以得出：3.0mMMgCl2是該實驗的最佳Mg2+濃度，并且疑問解答 MissQ，答案明顯是不能的。采用飽和的熒光是進行HRM分析的必mix中所含有的高分辨在PCR時以飽和的濃度加入，不會抑制PCR反應(yīng)。在進行HRM分析時，由于飽和占據(jù)了DNA雙鏈上每一對堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時，立即與雙鏈脫離，使得熒光信號發(fā)生較大的變化。飽和DNA解鏈過程中就不會發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。而傳統(tǒng)的熒光SybrGreen是非飽和，濃度過高PCR反應(yīng)且容易出現(xiàn)假，特異性下降等情況。非飽和常發(fā)生位置上的遷移，從而對熒光信號沒有大的影響。使用非飽和性只能區(qū)分片段大GCSYBRGreen不適合用來做高分辨率的HRM實驗。MissQ，這問題很好。法無法區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的問題，我們可以通過引物，模板，Mg2+濃度等方面來優(yōu)化HRM實驗。對于引物設(shè)計，要保證退火溫度在60℃左右，擴增片段長度小于250bp，最5-30ng/20ulCq30Mg2+PCR的優(yōu)化起著至關(guān)重要的作用，從上述的實驗結(jié)果中我們可擴增曲線的平臺期較低。綜