國內(nèi)外布病檢測技術(shù)與蛋白抗原的篩選研究進(jìn)展綜述,畜牧獸醫(yī)論文布魯氏菌病(簡稱布病)是一種重要的人畜共患病,也是引起動物繁衍障礙的主要疾病之一。臨診上動物以流產(chǎn)、胎盤炎、附睪和睪丸炎為主要特征;人群感染多呈慢性型,以全身乏力、多個組織器官受損為主要表現(xiàn)。近年來,我們國家人、畜間布病呈高發(fā)態(tài)勢,嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展和人群身體健康,被列為國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(20202020年)的三大疾病(口蹄疫、高致病禽流感和布病)之一。同時,該病在國際上也被列為重要的生物恐懼戰(zhàn)劑之一。一直以來,動物群布病的凈化困擾著世界各國,很多發(fā)達(dá)國家不惜成本、歷時數(shù)十年,通過檢疫、陽性動物撲殺-補(bǔ)償?shù)却胧?先后實現(xiàn)了家畜布病凈化目的。在我們國家,牛、羊飼養(yǎng)密度相對較高,動物基數(shù)大、陽性動物比例高,控制布病主要通過疫苗免疫與檢測診斷相結(jié)合的方式方法。理論上,疫苗免疫能夠提高動物群對布病的抵抗力,控制疫病的蔓延;檢測診斷除能夠監(jiān)測疫苗免疫狀態(tài)和效果外,還能及時對自然感染動物進(jìn)行辨別,對布病的凈化起到促進(jìn)作用。但是,現(xiàn)有布病疫苗免疫在一定程度上阻止布病蔓延的同時也給布病檢測技術(shù)提出挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有布病檢測技術(shù)不能區(qū)分疫苗接種與自然感染動物,致使免疫群內(nèi)患病動物仍然存在帶菌、排菌現(xiàn)象,病原擴(kuò)散蔓延造成的疫情狀態(tài)難以消除,時刻威脅著公共衛(wèi)生安全。因而,迫切需要簡單、快速、準(zhǔn)確、能鑒別診斷的布病檢測技術(shù)。針對布病診斷和檢測技術(shù)的研究一直在進(jìn)行,筆者對當(dāng)下國內(nèi)外布病檢測技術(shù)的研究現(xiàn)在狀況和蛋白抗原的挑選進(jìn)展進(jìn)行概述,旨在促進(jìn)我們國家布病檢測技術(shù)的多元化、多用處,盡快推進(jìn)布病檢測技術(shù)的研究進(jìn)程。1、病原學(xué)檢測方式方法1.1細(xì)菌學(xué)方式方法迄今,細(xì)菌學(xué)方式方法仍然是病原診斷的主要方式方法,包括樣品涂片顯微鏡檢和細(xì)菌分離培養(yǎng)、鑒定。固然檢出率很低,但卻是布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在這里方面,高敏感選擇性培養(yǎng)基及病料樣品采集的及時性和處理設(shè)備的有效使用直接影響檢測結(jié)果。針對不同臨床病例,應(yīng)采集適宜的病料樣品,如流產(chǎn)的胎兒通常采集的樣品是胃內(nèi)容物、肺臟和脾臟;成年動物的樣品是胎盤、胎膜、陰道分泌物、奶樣、精液和關(guān)節(jié)液等;死亡動物尸體優(yōu)先選擇的組織為乳腺、頜下、腮腺、肩前、髂內(nèi)淋逢迎和脾臟等。上述所有的樣品采集時必須獨立包裝,并冷藏后立即運(yùn)送到實驗室或者暫時凍存于防漏的冷凍容器內(nèi)。除此之外,急性期病人的血液也是較為常用的細(xì)菌分離用樣品。1.2分子生物學(xué)方式方法近年來,分子生物學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,被逐步應(yīng)用于疾病的診斷和其他研究領(lǐng)域,開拓了布病臨床診斷和檢測的新途徑。分子生物學(xué)技術(shù)在布病診斷中的應(yīng)用,也經(jīng)歷了從傳統(tǒng)PCR到熒光定量PCR再到環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)的發(fā)展歷程。1992年,Baily等根據(jù)bcsp31基因設(shè)計引物B4/B5,建立了一種布魯氏菌屬特異性的PCR檢測方式方法。該對引物一直沿用至今,且是當(dāng)下檢測布魯氏菌應(yīng)用最廣的引物對之一。1994年,Bricker等基于插入序列IS711在不同種型布魯氏菌基因組中的多態(tài)性,針對牛種、羊種、豬種和綿羊附睪種布魯氏菌設(shè)計了不同的引物,來鑒定和區(qū)分牛種布魯氏菌生物1型、2型和4型、羊種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌和豬種生物1型,建立了AMOS-PCR方式方法。另外,鐘旗等也應(yīng)用AMOS-PCR開展了布魯氏菌種、型鑒定研究,結(jié)果表示清楚該方式方法的特異性、敏感性均高于細(xì)菌分離和血清學(xué)診斷方式方法,且能區(qū)分布魯氏菌各個種和部分生物型。除傳統(tǒng)PCR技術(shù)外,實時熒光定量PCR(Real-timePCR)是新近發(fā)展的PCR技術(shù)。2001年,Redkar等應(yīng)用Real-timePCR鑒別了牛、羊、豬種布魯氏菌。Probert等根據(jù)bcsp31基因設(shè)計引物,使用多重?zé)晒舛縋CR方式方法對122株布魯氏菌進(jìn)行鑒別,證實該方式方法能夠在2~3h內(nèi)對不同種的布魯氏菌進(jìn)行快速、敏感、準(zhǔn)確地鑒別。LAMP擴(kuò)增方式方法是一種靈敏性比擬高的檢測方式方法,其靈敏性比傳統(tǒng)PCR高出10~1000倍,到達(dá)甚至高于熒光定量PCR的檢測水平。2018年,許鄒亮等根據(jù)布魯氏菌omp25基因設(shè)計引物,建立的基于顏色斷定的布魯氏菌LAMP檢測方式方法能夠檢出濃度低至17fg的布魯氏菌基因組DNA,靈敏性較高;且具有檢測特異、設(shè)備要求簡單等特點,適用于基層獸醫(yī)部門進(jìn)行布魯氏菌的快速檢測。布魯氏菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)依靠于特異性診斷用基因。截止當(dāng)下,已挑選出多個具有布魯氏菌屬特異性的基因,包括IS711遺傳片段、16SrRNA、31和4ku外膜蛋白編碼序列、bcsp31、omp2、bp26和per等,除此之外幾乎所有的臨床樣品如全血、血清、白細(xì)胞、組織塊、乳汁、關(guān)節(jié)滑液、陰道拭子、精液、尿液和石蠟切片等均可作為PCR方式方法的檢測對象?？偟膩碇v,基于PCR技術(shù)構(gòu)成的布魯氏菌分子生物學(xué)檢測方式方法比細(xì)菌學(xué)方式方法簡單、快速、實用,并且還在不斷發(fā)展成熟。然而,該類方式方法也不同程度的受多個因素的影響,如不同樣品DNA提取方式方法、提取質(zhì)量和濃度、引物特異性和敏感性等都會影響檢測結(jié)果,并且在疫苗菌株與野毒菌株差異基因未知的情況下,分子生物學(xué)方式方法也不能完全區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動物。因而,該方式方法作為布魯氏菌實驗室常規(guī)檢測方式方法,其敏感性、特異性、鑒別性、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證還需用大量臨床樣品進(jìn)行全面驗證。2、血清學(xué)檢測方式方法盡管細(xì)菌分離是布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),然而血清學(xué)診斷方式方法卻是非常有效的布病輔助診斷措施。血清學(xué)方式方法操作方便,幾乎無感染風(fēng)險,不需要特殊的儀器設(shè)備,很快便可獲得檢測結(jié)果,因而,血清學(xué)檢測方式方法在實際生活中可行性更高層次層次,且更經(jīng)濟(jì)。固然單逐一種血清學(xué)方式方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性不能到達(dá)100%,但能夠同時采取多種方式方法進(jìn)行綜合判定。當(dāng)下,最有效且節(jié)約成本的檢測程序是先選擇敏感性好、操作簡便快速的方式方法對大批血清樣品進(jìn)行初篩,然后再選用敏感性和特異性均較好的檢測方式方法對陽性血清樣品進(jìn)行確診。當(dāng)然,在進(jìn)行布病血清學(xué)診斷的經(jīng)過中,選用國際認(rèn)可的檢測方式方法,使用標(biāo)準(zhǔn)化的抗原和參考血清(標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)是必不可少的。1897年,Wright等初次使用試管凝集試驗(SAT)對布病進(jìn)行診斷。隨后,為了提高檢測的準(zhǔn)確性,研究人員對試管凝集試驗進(jìn)行改進(jìn),同時也發(fā)展出多個其他的血清學(xué)檢測方式方法。如虎紅平板凝集試驗(RBPT)、試管凝集試驗(SAT)、乳汁環(huán)狀凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、熒光偏振試驗、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗和熒光免疫分析等。華而不實,虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗是我們國家布病初篩和確診的常用血清學(xué)方式方法,但是這2種方式方法均不能區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動物。1976年,Cavleson等初次將酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方式方法應(yīng)用于牛布病的檢測,并發(fā)現(xiàn)其靈敏性比SAT高10~100倍。臨床常用ELISA方式方法包括間接ELISA(i-ELISA)、競爭ELISA(c-ELISA)和斑點酶聯(lián)免疫試驗(Dot-ELISA)等。i-ELISA是以光滑型布魯氏菌菌體脂多糖(S-LPS)為包被抗原,檢測IgGs或IgG亞型,但因其不能分辨疫苗免疫和自然感染動物產(chǎn)生的抗體,只能用于非免疫家畜普查檢測而不是免疫家畜的診斷。為解決該問題,Nielsen等建立了c-ELISA方式方法,即在ELISA微孔內(nèi)除包被光滑型布魯氏菌菌體脂多糖(S-LPS)外,還參加O型多糖(OPS)特異表位單克隆抗體。c-ELISA利用特異性單克隆抗體能有選擇地抑制結(jié)合疫苗所產(chǎn)生的抗體,因此可消除因接種疫苗而產(chǎn)生的殘存余留抗體所引起的反響。2004年,c-ELISA方式方法以其高特異性和敏感性的優(yōu)點被OIE列為診斷和去除牛布魯氏菌病的推薦方式方法。近年來,關(guān)于ELISA檢測方式方法的研究報道相當(dāng)多,然而其檢測效果的關(guān)鍵在于抗原的選用。當(dāng)下廣泛使用的抗原主要有脂多糖和外膜蛋白,而現(xiàn)用布病疫苗多為光滑型菌,接種后能夠產(chǎn)生針對脂多糖的抗體,進(jìn)而導(dǎo)致上述血清學(xué)方式方法難以區(qū)別自然感染和疫苗免疫動物,檢疫陽性動物經(jīng)常被養(yǎng)殖業(yè)主稱作免疫動物以逃避撲殺政策的施行。除此之外,由于布魯氏菌OPS與耶爾森O:9和大腸桿菌O157:H7的抗原構(gòu)造幾乎完全一致,血清學(xué)檢測時經(jīng)常出現(xiàn)穿插反響,進(jìn)而不利于布病的正確診斷。這也正是當(dāng)下布病防控中碰到的瓶頸問題之一。3、檢測用布魯氏菌免疫原性蛋白的挑選布魯氏菌感染后,具有免疫原性的蛋白抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體,通過檢測該特異性抗體的有無及產(chǎn)生量的情況能夠?qū)Σ疾∵M(jìn)行診斷?？紤]到當(dāng)下布病檢測方式方法的瓶頸問題,有必要挑選其他特異性蛋白抗原,建立新的診斷方式方法進(jìn)而知足臨床需要。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用,科研人員將注意力轉(zhuǎn)移到布魯氏菌蛋白上來,挑選具有鑒別診斷特性的布魯氏菌蛋白成為布魯氏菌病診斷方式方法研究的重點。2018年,顧超慧等通過2-D電泳比擬了強(qiáng)毒株16M和疫苗株M5的蛋白組成差異,找出13個蛋白差異點,證實布魯氏菌強(qiáng)毒株和疫苗株在蛋白水平上有差異可尋。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌蛋白上千種,華而不實外膜蛋白,Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白及胞質(zhì)蛋白等都是近年來研究的熱門。尤其外膜蛋白,因其處于菌體最外層的外膜上,在布魯氏菌感染經(jīng)過中始終與宿主細(xì)胞成分接觸或互相作用,誘導(dǎo)細(xì)胞病理變化或免疫學(xué)反響,因而外膜相關(guān)蛋白在感染和免疫中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。20世紀(jì)80年代,布魯氏菌主要的外膜蛋白(Outermembraneproteins,Omps)被初次確定具有免疫原性和抗原保衛(wèi)作用。更為重要的是,截止當(dāng)下未曾出現(xiàn)關(guān)于外膜蛋白存在穿插反響的報道,這些特點正符合布病檢測用靶抗原的要求。Bp26(Omp28)是布魯氏菌的優(yōu)勢抗原,在感染宿主體內(nèi)可檢測到Bp26蛋白的抗體。2018年,Thavaselvam等以重組Bp26蛋白為抗原,建立了i-ELISA和斑點印跡技術(shù)。與RBPT相比,這2種方式方法的敏感性分別為97.50%和82.05%,特異性分別為85.59%和92.41%。2018年,Liu等證實Bp26作為檢測綿羊附睪種布魯氏菌的抗原,固然檢測的敏感度不及O-PS,但能夠有效的區(qū)分自然感染動物和bp26基因突變株免疫的動物。然而,Xin等研究發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)Bp26蛋白抗體的產(chǎn)生與感染的布魯氏菌種型及宿主特異性有關(guān),僅羊種布魯氏菌16M和M28感染的綿羊、羊種布魯氏菌16M和流產(chǎn)布魯氏菌2308感染的山羊體內(nèi)檢測到Bp26蛋白的抗體,因而用Bp26作為抗原建立的ELISA方式方法具有一定得局限性。有學(xué)者將Omp10和Bp26外膜蛋白聯(lián)合應(yīng)用于布魯氏菌的血清學(xué)檢測,不僅能夠提高檢測的敏感性和準(zhǔn)確性,也能夠區(qū)分自然感染與疫苗接種反響,具有良好的應(yīng)用前景。另外Omp31、Omp25、Omp16和Omp19等外膜蛋白,也被證實是布魯氏菌的免疫原性蛋白,進(jìn)而用于檢測方式方法的建立。除外膜蛋白外,Hortensia等重組了VirB1、VirB5、VirB11和VirB124個Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VirB12可與感染羊血清發(fā)生反響。Tan等以重組的virB5蛋白為抗原建立的ELISA方式方法,對400份血清樣品檢測的敏感性為88.2%,特異性為97.8%,與SAT方式方法的符合率達(dá)94.8%。VirB8蛋白是布魯氏菌感染早期分泌的蛋白,在布魯氏菌感染后4h即可檢測到VirB8抗體,能夠用于布病的早期檢測。P39是一種布魯氏菌胞質(zhì)結(jié)合蛋白,同屬于胞質(zhì)結(jié)合蛋白的還有P15和P17。Letesson等以P15-P39作為抗原,建立的i-ELISE方式方法具有很高的敏感性,自然感染的綿羊和山羊血清的檢出率分別為80%和96%。蘋果酸脫氫酶(MDH)是三羧酸循環(huán)中的一種非常關(guān)鍵的酶,近來在流產(chǎn)布魯氏菌中,發(fā)現(xiàn)該酶也是一種具有免疫原性的膜相關(guān)蛋白,不僅在布魯氏菌毒力和致病經(jīng)過中起了重要的作用,重組蛋白還能夠與布病陽性血清發(fā)生反響,因而,MDH也有望成為布病血清學(xué)診斷用候選蛋白抗原。另外,Xu等通過微矩陣的方式方法,利用99份處于不同年齡以及布魯氏菌不同感染時期的病人血清,從107個布魯氏菌蛋白中挑選出具有較高敏感性的蛋白BMEII0318、BMEII0513、BMEI0748和BMEII1116等,能夠作為布病血清學(xué)診斷的候選抗原。其研究結(jié)果提示,在對布魯氏菌蛋白抗原的研究中,不同感染時期的優(yōu)勢抗原的表示出是不一樣的,研究不同蛋白抗體的消長規(guī)律,利用多個蛋白聯(lián)合建立布病檢測方式方法,將是布病檢測方式方法研究的重要方向。Ciocchini等建立了一種新型的糖蛋白結(jié)合物偶聯(lián)磁珠法,該方式方法以耶爾森O:9的多糖和蛋白結(jié)合物為抗原,偶聯(lián)磁珠后對人臨床血清樣品進(jìn)行檢測。當(dāng)檢測閾值為13.20%時,該方式方法檢測的敏感性達(dá)100%,特異性達(dá)98.57%;當(dāng)閾值為16.15%時,檢測敏感性達(dá)93.48%,特異性達(dá)100%。由此看來,這種新型的糖蛋白結(jié)合物偶聯(lián)磁珠法也未嘗不是一種有效的布病診斷方式方法,但需要大量臨床樣品的驗證。相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的不斷成熟,對蛋白的研究也會不斷深切進(jìn)入,布病檢測用靶蛋白抗原的鑒定及檢測方式方法的建立也將獲得很大的突破。4、小結(jié)通常情況下,布病確實診相對較為容易,但也不乏比擬特殊的病例。細(xì)菌分離是布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但是細(xì)菌分離也存在一些固有的問題,如樣品采集繁瑣、分離困難、耗材耗時和生物安全等。因而,很多機(jī)構(gòu)傾向于選擇其他的更為簡單、