第四章轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)轉(zhuǎn)基因水生生物概況轉(zhuǎn)基因水生生物的研究始于20世紀(jì)80年代初，1985年首例轉(zhuǎn)基因魚在中國誕生,現(xiàn)已涵蓋幾乎各個類型的水生生物。轉(zhuǎn)基因水生生物一旦釋放到環(huán)境（開放水體）中，人類往往難以有效掌控，也引起人們對其安全性的顧慮，使轉(zhuǎn)基因水生生物的商業(yè)化舉步為艱。只有轉(zhuǎn)基因羅非魚的小規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)（英國）。由于轉(zhuǎn)基因水生生物對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響仍有較大程度的不可預(yù)測性，其安全性還不能得到切實的證明，需要更多的研究、監(jiān)測和論證。第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、轉(zhuǎn)基因水生生物的發(fā)展概況1

已取得的成就1983-1985年，中科院水生所朱作言院士團(tuán)隊將人GH基因轉(zhuǎn)入鯽魚、泥鰍和金魚受精卵，獲得快速生長的轉(zhuǎn)基因魚；1997年，章懷云將紅鯉總DNA導(dǎo)入草魚受精孵得到體形和體色發(fā)生變異的個體。1998年,王鐵輝將團(tuán)頭魴總DNA導(dǎo)入草魚受精卵，獲得抗病力強(qiáng)的子代。其他成果包括：轉(zhuǎn)GFP基因蝦、轉(zhuǎn)羊GH基因蝦、轉(zhuǎn)抗凍基因大西洋鮭、轉(zhuǎn)人GH基因羅非魚、轉(zhuǎn)抗凍基因銀大馬哈魚、轉(zhuǎn)人GH基因虹鱒、等等

第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)“全魚”GH基因黃河鯉(左)及其對照魚第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日草鯉魚轉(zhuǎn)基因虹鱒

虹鱒第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

未來發(fā)展的趨勢改良養(yǎng)殖性能：提高抗病性、抗逆性；加快生長速度，提高餌料利用率；耐高鹽、耐低鹽、耐凍、耐熱、耐缺氧、耐污染?？焖儆N：精準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因，可打破種間、屬間、科間、動植物、動物與微生物之間的生殖隔離。生產(chǎn)醫(yī)藥制品：激素類藥品、水生生物反應(yīng)器生產(chǎn)重要的生物活性物質(zhì)。研制不育轉(zhuǎn)基因魚或孤雌生殖轉(zhuǎn)基因魚防止轉(zhuǎn)基因魚與同類或近緣種雜交。第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日3

尚待解決的問題技術(shù)還處于初級階段，在定點整合、可控表達(dá)、轉(zhuǎn)基因水生生物安全性等方面仍需完善和成熟。外源基因在受體細(xì)胞中的定點整合和可控表達(dá)：重點解決整合的隨機(jī)性和拷貝數(shù)變異，因為只有極少數(shù)才能發(fā)生同源整合。PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)MThGH基因紅鯉各世代的轉(zhuǎn)基因陽性率

檢測世代P0代F1代F2代F3代F4代

陽性P0陽性F1陽性F2陽性F3

繁殖方式群體繁殖群體繁殖群體繁殖群體繁殖

檢測魚數(shù)1224222035

陽性數(shù)717171833

陽性率58.3%70.8%77.3%90.0%94.3%第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因水生生物的培育與繁殖性能：

生長是否正常？

成熟和繁殖能力是升是降？

轉(zhuǎn)入基因的遺傳穩(wěn)定性？轉(zhuǎn)基因水生生物應(yīng)用的安全性：

生態(tài)安全—如何避免逃逸、如何防止成為入侵生物

食用安全—轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物如生長素或性激素對人

體或取食動物的安全性。轉(zhuǎn)基因操作的安全性：

目的基因來源、結(jié)構(gòu)、功能和用途；

克隆載體的來源、特性及安全性；

重組DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制、整合位置效應(yīng)；

使用過程中的安全性。

第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)基因水生生物的類型1

轉(zhuǎn)基因魚人類食物消費對魚的偏好、把魚類當(dāng)作食物蛋白質(zhì)的重要來源、以及魚類新品種選育的需要是轉(zhuǎn)基因魚的意義所在。

魚類轉(zhuǎn)基因研發(fā)的概況轉(zhuǎn)移成功的目的基因：GH基因、干擾素基因、蛋白質(zhì)基因、抗逆性和耐逆性基因；轉(zhuǎn)“全魚”基因魚的技術(shù)體系：插入片段的各個構(gòu)件（啟動子、調(diào)控區(qū)和結(jié)構(gòu)基因）都來自魚類。轉(zhuǎn)基因魚的特點：材料來源豐富、操作管理方便、生

長發(fā)育可控性好?；蜣D(zhuǎn)移的主要方法：顯微注射、電脈沖、精子攜帶

總體上，魚類轉(zhuǎn)基因研究仍處于發(fā)展階段，商品化極少。第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

轉(zhuǎn)基因?qū)ξr轉(zhuǎn)基因?qū)ξr的意義：豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、價格合適、需求量大，但對蝦養(yǎng)殖業(yè)面臨病害困擾以及品質(zhì)退化使利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決新品種選育周期長、有用基因來源少等難題的一個重要的新途徑。對蝦轉(zhuǎn)基因的方法：

顯微注射法、電脈沖法、基因槍法、病毒介導(dǎo)法、精子載體法。存在問題：

技術(shù)問題—轉(zhuǎn)基因效率低、不穩(wěn)定、難重復(fù)、畸形多

材料問題—目的基因來源、表達(dá)載體效率、突變

安全性問題第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日3

轉(zhuǎn)基因貝類轉(zhuǎn)基因貝類的意義：

貝類養(yǎng)殖作為新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但種苗仍采自野生種，累代養(yǎng)殖已呈現(xiàn)退化，轉(zhuǎn)基因貝類為培育生長快、品質(zhì)優(yōu)、抗病耐逆新品種提供了一個新的途徑。貝類轉(zhuǎn)基因的方法：

電脈沖—精子介導(dǎo)法、聚乙烯亞胺—精子載體法轉(zhuǎn)基因貝類存在的問題：

精子載體轉(zhuǎn)基因的機(jī)制不清楚；外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率低；外源基因與貝類基因的整合與互作機(jī)理。第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性評價轉(zhuǎn)基因水生生物以轉(zhuǎn)基因魚為標(biāo)志，是最早開展研究的轉(zhuǎn)基因生物種類之一，但由于公眾和學(xué)界對其安全性的顧慮，商業(yè)化應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物和其他轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因水生生物因其不確定性更多、難標(biāo)記和追蹤、易逃逸和擴(kuò)散，其問題有其相對特殊的地位。由于水生生態(tài)系統(tǒng)的重要性和特殊性（交互擴(kuò)散滲透、有害物質(zhì)積聚、結(jié)構(gòu)相對簡單），易受外來因素干擾，對轉(zhuǎn)基因水生生物的防范難度加大。轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性受到各國重視，但現(xiàn)行的生物安全法規(guī)主要是針對陸生動植物和微生物，對轉(zhuǎn)基因水生生物的監(jiān)管需要在法律法規(guī)和管理體制方面不斷完善。第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性評價1

轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性評價的必要性和作用轉(zhuǎn)基因水生生物安全性評價的必要性轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性已引起社會各界的廣泛關(guān)注，從技術(shù)層面擴(kuò)展了社會生活的各個層面。轉(zhuǎn)基因水生生物的安全性不能單純依靠科學(xué)技術(shù)解決，還必須有配套的法律、法規(guī)和行政監(jiān)管。

水生生物多樣性保護(hù)因水生生態(tài)系統(tǒng)簡單性和脆弱性使轉(zhuǎn)基因水生生物的商業(yè)化應(yīng)用的安全性更加引起關(guān)注，必須進(jìn)行全面和科學(xué)的評價。轉(zhuǎn)基因水生生物安全評價的作用

為做出正確決策提供科學(xué)合理的依據(jù)；

消除公眾的凝慮和誤解，保證轉(zhuǎn)基因水生生物的研發(fā)和應(yīng)用健康有序發(fā)展；

維護(hù)環(huán)境安全和保障人類健康。第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

轉(zhuǎn)基因水生生物安全性研究的主要方面供體和受體的生物學(xué)研究：

形態(tài)、生理、生態(tài)、習(xí)性、行為等的安全與可控轉(zhuǎn)基因操作過程的安全性分析：

目的基因、載體、導(dǎo)入途徑等的安全性及準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)基因水生生物的生物學(xué)特性研究：

與受體生物相比安全性高、低變化，危險因素？轉(zhuǎn)基因水生生物的遺傳安全性研究：

基因漂移的可能性、轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性轉(zhuǎn)基因水生生物與其他水生生物的相互作用研究：

生態(tài)位、競爭、共生共棲、食物鏈、寄生、天敵計劃釋放轉(zhuǎn)基因水生生物的水體的調(diào)查。第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日生態(tài)安全問題：

逃逸、雜交擴(kuò)散、對多樣性的影響、生態(tài)平衡可能的擴(kuò)散途徑和防范措施：

主動擴(kuò)散—因自身生存需要而在不同水域間轉(zhuǎn)移

被動擴(kuò)散—生殖回游和索餌回游、人類水利工程、

放養(yǎng)和引種馴化、洪災(zāi)等自然災(zāi)害消費安全：

食用安全、貯存安全、加工安全、添加物安全

實質(zhì)等同性原則社會認(rèn)同

經(jīng)濟(jì)回報、公眾接受程度、歷史宗教及文化心理、社會倫理、生物恐怖主義。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的紛爭是客觀存在，關(guān)鍵是保障消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日3

轉(zhuǎn)基因水生生物安全評價的標(biāo)準(zhǔn)和程序安全等級的四級分類標(biāo)準(zhǔn)I級—不危險；Ⅱ級—低度危險；Ⅲ級—中度危險；IV級—高度危險安全等級劃分程序

供體、受體基因操作過程

轉(zhuǎn)基因水生生物及其產(chǎn)品

釋放環(huán)境后的影響及檢測、監(jiān)管、控制第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日

確定受體生物安全等級→Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級↓↓↓確定基因操作對受體生→Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型↓物安全等級影響類型↓

↓↓↓↓確定轉(zhuǎn)基因生物安全等級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級↓↓↓確定生產(chǎn)、加工活動對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型↓轉(zhuǎn)基因生物安全性影響↓↓↓↓↓確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全等級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級↓↓確定釋放環(huán)境對安全性影響確定監(jiān)控措施有效性↓↓綜合評價的結(jié)論與建議第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)基因水生生物的安全管理1

基因操作安全性評價的內(nèi)容第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日2轉(zhuǎn)基因操作的安全性轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)系統(tǒng)：目的基因編碼的天然蛋白質(zhì)的安全性；轉(zhuǎn)基因構(gòu)件及其序列或酶切圖譜、轉(zhuǎn)基因?qū)κ荏w動物及其近緣種的安全性；轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、調(diào)控機(jī)理、及其對受體動物及其近緣種表達(dá)調(diào)控的影響。外源基因整合位置及其對受體基因組特定基因的影響：基因整合的位置、受阻斷或缺失靶基因的功能，對受體動物生活力或生殖能力的影響。轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的安全性鑒定：非目的基因片段對受體動物及其近緣種的安全性；目的基因表達(dá)產(chǎn)物的安全性。轉(zhuǎn)基因體系安全性評價：主要針對病毒類載體。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

目的基因克隆、體外重組及轉(zhuǎn)基因動物制備方法轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中目的基因克隆和體外重組：

選擇目的基因和載體的安全性；

組裝完整的表達(dá)栽體的安全性；外源基因(目的基因)擴(kuò)增制備、貯藏的安全性。轉(zhuǎn)基因動物的制作方法：

顯微注射—隨機(jī)整合、插入突變；

精子載體法—體外授精法

卵母細(xì)胞內(nèi)精子顯微注射法

即將正常精子進(jìn)行破膜處理后，與帶目的基因的表達(dá)載體共孵育，然后通過顯微注射注入處于減數(shù)分裂II期的卵母細(xì)胞質(zhì)中，受精后將早期胚胎轉(zhuǎn)入母體子宮內(nèi)發(fā)育成后代轉(zhuǎn)基因動物。第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒，能直接感染宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA。整合到細(xì)胞基因組DNA中；

病毒DNA中段可被取代，重組后的DNA同樣能夠整合到細(xì)胞基因組DNA中，并能被轉(zhuǎn)錄和包裝；

目的基因能以逆轉(zhuǎn)錄病毒為媒介轉(zhuǎn)移至受體動物中，制備轉(zhuǎn)基因動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法操作簡單、效果穩(wěn)定、外源基因整合率高、宿主范圍廣；但容量有限、難以整合進(jìn)生殖系統(tǒng)；有可能激活某些有害基因(如原癌基因)或失活某些有用基因(如腫瘤抑制基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因)。第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移胚胎干細(xì)胞是指囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未分化的細(xì)胞，理論上是全能性的細(xì)胞，在一定條件下可分化為其他類型的細(xì)胞，也可發(fā)育成完整個體。

將目的基因轉(zhuǎn)移入胚胎干細(xì)胞，再重新導(dǎo)入囊胚中，可培育出轉(zhuǎn)基因動物個體，但得到的多是嵌合體，有些能傳代表達(dá)目的基因。體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移和克隆

以體細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因受體，導(dǎo)入目的基因后再進(jìn)行體細(xì)胞擴(kuò)增，將擴(kuò)增的細(xì)胞作為供體，將其細(xì)胞核導(dǎo)入去核受精卵中，培養(yǎng)到胚細(xì)胞團(tuán)后植入子宮發(fā)育為新個體表達(dá)目的基因。基因打靶法—直接將目的基因通過基因槍射入受體細(xì)胞，多拷貝進(jìn)入，少數(shù)重組。

第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的安全性評價1轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品安全性評價的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的穩(wěn)定性；生產(chǎn)、加工活動對轉(zhuǎn)基因動物安全性的影響；轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因動物在環(huán)境安全性方面的差異；轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因動物在對人類健康影響方面的差異。根據(jù)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品評價的“實質(zhì)等同性原則”，對轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的安全性評價是以在預(yù)期狀況下使用不會對人造成傷害為基礎(chǔ)，形成“以產(chǎn)品為基礎(chǔ)”的管理模式、“以技術(shù)為基礎(chǔ)”的管理模式和“兼顧技術(shù)和產(chǎn)品”的管理模式。第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日2轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的純化與鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的回收及生產(chǎn)批號確定

產(chǎn)物回收的過程(擠奶、放血、摘取器官)、程序及其安全措施有效性(無菌、潔凈、保鮮、效價)；產(chǎn)品分離純化過程、程序及安全措施的有效性；

確定生產(chǎn)批號的條件與標(biāo)準(zhǔn)：動物批量大小、收儲時間；原料無菌過濾前經(jīng)歷時間、認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)；產(chǎn)品質(zhì)量及生產(chǎn)過程監(jiān)測及檢驗方法每靈敏度。宿主動物的不定因子、產(chǎn)物組織來源及病原檢測

不定因子或化學(xué)污染物存在及隨產(chǎn)品分離純化而濃集的可能性；潛在地含有病原體及在產(chǎn)品中殘留的可能性；

檢測方法的有效性及靈敏度。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日產(chǎn)品的同度與純度分析及純化產(chǎn)品批量投放檢測

原料中已知的和可能存在的人類病原體檢測；

終產(chǎn)品中免疫原和有毒物質(zhì)存在與否及量值；

不同批次產(chǎn)品之間理化性質(zhì)的均一性及效價；

雜質(zhì)、污染物、免疫原等的檢測結(jié)果。轉(zhuǎn)基因動物作為組織供體的特殊問題

作為組織器官供體時出現(xiàn)致病病毒的可能性；

轉(zhuǎn)基因動物組織器官中