關于基因工程與基因組學第1頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相關技術四、基因工程的發(fā)展應用第2頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三一、基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程，利用工程技術的方法改造和修飾生物體，使其產生新的性狀或產品，從而改良生物體的一種遺傳學手段。核心是利用重組DNA技術，在分子水平上操作修飾改變生物體遺傳結構?；蚬こ蹋╣eneengineering）：利用人工的方法把生物的遺傳物質在體外進行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。第3頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三二、基因工程的工具酶內切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease），也稱限制性酶(restrictionenzyme),能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。第4頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三Eco

RⅠ

屬名種名菌株名序號（一）限制性核酸內切酶第5頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三常見內切酶第6頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三（二）DNA連接酶連接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的缺刻。如：

E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶第7頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三

載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞(hostcell)進行擴增或表達的運載工具稱為載體。載體也是DNA分子。常用的載體有細菌質粒、噬菌體、病毒等。經改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要經過人工改造。細菌人工染色體（BAC）、酵母菌人工染色體（YAC）和人類人工染色體（HAC）第8頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體載體YAC（1Mb）第9頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制，而且能帶動外源DNA一起復制。②具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。④具有一個選擇標記基因。第10頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三

獲得外源DNA片段（分）

限制性內切酶切割外源DNA片段與載體（切）

外源DNA片段與載體連接（接）

重組DNA分子轉入宿主細胞（轉）

重組子的篩選與鑒定（篩）

目的基因的確認與分析三、基因工程的流程及相關技術第11頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三（一）外源DNA片段的分離方法構建基因組文庫分離法差別顯示反轉錄PCR利用聚合酶鏈式反應技術擴增目的基因第13頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三1.構建基因組文庫分離法

用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構成了這種生物的基因組文庫。若只儲存某生物基因組的部分遺傳信息，即構成部分基因組文庫。供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段分別連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息。保存、篩選第14頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三差別顯示分析基本流程2.差別顯示反轉錄PCR（DDRT-PCR）第15頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三3、利用聚合酶鏈式反應技術擴增目的基因（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不對稱PCR（4）錨定PCR（5）長程PCR（6）反轉錄PCR第16頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三4、人工合成基因根據已知的基因序列，或根據氨基酸序列推測DNA序列將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來，可以很快地人工合成基因。第17頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三通過用相同的限制性核酸內切酶切割，連接形成一個重組DNA分子（二）、外源DNA片段與載體的切割和連接第18頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三（三）、重組DNA轉入宿主細胞1.重組DNA轉入原核細胞

熱激轉化法電穿孔轉化法2.重組DNA轉入真核細胞

農桿菌轉化法第19頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三重組DNA感受態(tài)細胞

冰浴混合、靜置42oC熱激加入培養(yǎng)基擴培轉化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱激轉化法第20頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三感受態(tài)細胞

電轉儀調為2.5kV25F

脈沖控制器200-400

質粒DNA

混合加入培養(yǎng)液37℃中速震蕩涂板（2）電穿孔轉化法第21頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三2.重組DNA轉入植物細胞農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法第22頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三（四）重組子的篩選與鑒定

核酸雜交PCR檢測測序生物學活性檢測1.插入抗性失活2.藍白斑篩選第23頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三1.插入失活篩選法第24頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三藍白斑篩選重組質粒第25頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三四、基因工程的發(fā)展應用1、基因工程是生物科學基礎研究的重要手段2、利用轉基因技術改良植物已取得很大進展并在生產上應用3、利用基因工程獲得大量重組的蛋白、疫苗藥物4、利用基因工程進行不同物種之間的基因傳遞提供了可能。轉基因動植物--“生物工廠”5、疾病診斷與基因治療6、環(huán)境保護第26頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三第27頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三4.利用基因工程改良動物第28頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三

推薦幾本參考書：

1、《基因工程原理與方法》，孫樹漢編，人民軍醫(yī)出版社

2、《基因工程原理》，吳乃虎編，科學出版社（側重原理）

3、《現(xiàn)代基因工程技術導論》，陳章良編，科學出版社（側重應用）

4、《分子克隆》(第三版)，J.Sambrooketal.科學出版社（具體的實驗方法，分子生物學研究的圣經）第29頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)基因組學一、基因組學概述二、基因組圖譜的構建三、基因組圖譜的應用四、后基因組學第30頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三基因組(genome)泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

一、基因組學概念及范疇基因組學(genomics)就是發(fā)展和應用DNA制圖、測序新技術以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結構及功能。第31頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三基因組學研究的最終目標獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關系闡明基因組的進化規(guī)律

第32頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三基因組學研究內容結構基因組學(structuralgenomics)

功能基因組學(functionalgenomics)

比較基因組學(comparativegenomics)第33頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三結構基因組學（structuralgenomics）

基因定位基因組作圖測定核苷酸序列第34頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三遺傳圖（連鎖圖）物理圖轉錄圖序列圖二、基因組圖譜的構建基因組計劃的第一個環(huán)節(jié)：構建基因組圖譜第35頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三1.遺傳圖

連鎖圖(linkagemap)，是指基因標志在染色體上的遺傳距離，即確定各基因在基因組中的相對位置和排列順序。遺傳距離通常由基因在四分體時期染色體交換過程中分離的頻率厘摩（cM）來表示。第36頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三遺傳標記（Geneticmarker）指可識別的等位基因。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。類型：形態(tài)標記（morphologicalmarker）細胞學標記(cytologicalmarker)

生化標記(biochemicalmarker)

分子標記(molecularmarker)第37頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三第38頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三2.、物理圖

以已知核苷酸序列的DNA片斷（序列標簽位點,STS）為“路標”，以堿基對作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。

DNA上兩點的實際距離，即確定基因在染色體上的實際排列順序，從而對基因定位。第39頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三3、轉錄圖

以EST（expressedsequencetag，表達序列標簽）為標記，根據轉錄順序的位置和距離繪制的圖譜。第40頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三4.、序列圖

序列圖是指整個人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖，既包括可轉錄序列，也包括非轉錄序列，是轉錄序列、調節(jié)序列和功能未知序列的總和。

這是人類基因組計劃最繁重、耗時最多的工作。第41頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!第42頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三人類基因組計劃1990，美國國立衛(wèi)生研究所和能源部投資＄30億，啟動了人類基因組計劃，預計15年時間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版2002，完成測序工作第43頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三國際人類基因組測序協(xié)作組（公共計劃組）由6個國家、20個研究中心的2000多位科學工作者組成。國家承擔的測序任務美國54%英國33%日本7%法國2.8%德國2.2%中國1%第44頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三1999年9月中國獲準加入人類基因組計劃，負責測定人類基因組全部序列的1%，負責第3號染色體3千萬核苷酸的序列測定工作。中國是繼美、英、日、德、法之后第6個國際人類基因組計劃參與者，也是參與這一計劃的唯一發(fā)展中國家。第45頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三人類基因組計劃1%測序中國實驗室第46頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三2000年6月26日

科學家公布人類基因組工作草圖，標志著人類在解讀自身“生命之書”的路上邁出了重要一步。第47頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三HGP對人類基因面貌的新發(fā)現(xiàn)基因數量少得驚人人類基因組中存在“熱點”和大片“荒漠”三分之一為“垃圾”DNA種族歧視毫無根據男性基因突變比例更高第48頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三2000年是基因組之年，完成了人類基因組的工作框架圖，完成了一系列模式生物和微生物的基因組序列分析。

2000年12月美、英等國科學家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜，這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。第49頁，共52頁，2023年，2月20日，星期三三、后基因組學（postgenomics)

完成一個生物體全部基因組測序后即進入功能基因組學階段，也稱后基因組階段——詳盡分析序列，描