sncRNA的結(jié)構(gòu)、功能及影響,生理學(xué)論文以往很多研究更為重視的是基因組中的編碼序列，而約98%的非編碼序列是隨著對(duì)基因組及其功能的研究深切進(jìn)入才逐步引起人們的重視。小分子非編碼RNA〔Smallnon-codingRNAs,sncRNAs〕是一類核苷酸長(zhǎng)度在20-30nt左右的非編碼RNA〔Non-codingRNA,ncRNA〕[1],過去被以為是剪切加工的剩余產(chǎn)物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)這一類小分子的生物學(xué)功能具有高度的組織特異性或發(fā)育階段特異性，逐步成為研究的熱門。當(dāng)前主要將ncRNAs分為3類，即piRNA〔Piwi-interactingRNA,與piwi蛋白互相作用的RNA〕、microRNA〔miRNA,微小RNA〕和si-RNA〔小干擾RNA〕[1].研究發(fā)現(xiàn)sncRNA介入生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平上的調(diào)控，華而不實(shí)miRNA和piRNA通路是雄性不育動(dòng)物模型研究中最重要的兩條途徑[2-4].一般情況下，miRNA調(diào)節(jié)精子構(gòu)成是通過靶向結(jié)合在轉(zhuǎn)錄本的3UTR區(qū)和下調(diào)細(xì)胞中特定的轉(zhuǎn)錄本來促進(jìn)精子的發(fā)育，而piRNA則在生精經(jīng)過中強(qiáng)烈抑制轉(zhuǎn)座子元件的表示出。本文綜合分析了精子構(gòu)成經(jīng)過中相關(guān)sncRNAs的構(gòu)造、功能、調(diào)控機(jī)制以及對(duì)動(dòng)物雄性不育的影響，以期為進(jìn)一步研究sncRNA的調(diào)控機(jī)制提供參考。1sncRNA概述真核生物細(xì)胞內(nèi)的RNA一般分為編碼RNA和非編碼RNA.當(dāng)前發(fā)現(xiàn)，人類基因組中有2%的序列介入編碼蛋白質(zhì)，即翻譯經(jīng)過中產(chǎn)生的mRNA屬于典型的可編碼RNA,其余為非編碼序列[5].sncRNAs是一類非編碼RNAs,即屬于不會(huì)編碼蛋白質(zhì)RNAs〔ncRNA〕的一部分。而ncRNA早在50年前就已被發(fā)現(xiàn)，1965年R.W.霍利[6]在面包酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的丙氨酸t(yī)RNA和之后發(fā)現(xiàn)的rRNA都是非編碼RNA;華而不實(shí)rRNA含量占總RNA的約82%,隨著研究的發(fā)展，如今越來越多的新型ncRNA得以被發(fā)現(xiàn)，如核小RNA〔snRNAs〕、小RNA〔miRNA〕、與Piwi蛋白結(jié)合RNA〔piRNA〕、長(zhǎng)鏈非編碼〔lnc-RNA〕等。ncRNA主要從轉(zhuǎn)錄來源、分子長(zhǎng)度、功能等進(jìn)行分類。從ncRNA轉(zhuǎn)錄來源分類，主要有內(nèi)含子型和基因間型，前者由基因中的內(nèi)含子序列轉(zhuǎn)錄而來，后者主要源于兩基因間DNA序列的轉(zhuǎn)錄[7].ncRNA核苷酸片段同時(shí)也具有高度的大小特異性，華而不實(shí)分子長(zhǎng)度多于200個(gè)核苷酸的通常被稱作長(zhǎng)鏈ncRNA,少于200個(gè)核苷酸的稱為短鏈ncRNA[8].sncRNAs屬于短鏈ncRNA,長(zhǎng)度在20-30nt左右。它主要包括小干擾RNA〔siRNA〕長(zhǎng)度在21-23nt,微小RNA〔miRNA〕長(zhǎng)度在19-25nt,生殖細(xì)胞含量豐富的與piwi〔p-elementinducedwimpytestis〕作用的RNA〔piRNA〕大部分在24-34nt[1].sncRNAs通常與高度守的Argonaute蛋白家族結(jié)合，該蛋白家族根據(jù)構(gòu)造特異性可要分為兩個(gè)亞家族:AGO和PIWI;兩類亞家族分別具有兩個(gè)特殊的構(gòu)造域，即PAZ〔Piwi-Argnonaute-zwille〕域和PIWI〔p-elementinducedwimpytestis〕域[3].在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中，miRNA、siRNA一般與AGO蛋白家族結(jié)合;而piRNA與piwi蛋白結(jié)合并且高度富集在生殖細(xì)胞中。miRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基本功能是負(fù)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，但是通過Dicer敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)后代生殖細(xì)胞中miRNA的含量大幅減少[3];還有相關(guān)實(shí)驗(yàn)通過對(duì)豬性成熟前后睪丸組織差異表示出miRNA鑒定及功能分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs在動(dòng)物睪丸發(fā)育成熟、生殖細(xì)胞的功能分化以及精子發(fā)生經(jīng)過中發(fā)揮著重要的作用[9].Watanabe等[10]研究發(fā)現(xiàn)病變的睪丸組織中發(fā)現(xiàn)piwi-RNA分子的初級(jí)加工產(chǎn)物遭到影響而次級(jí)加工產(chǎn)物未受影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)piwi蛋白家族〔MILI、MIWI2和MIWI3個(gè)成員〕是成功構(gòu)成精子所必需的一類蛋白家族，在精子構(gòu)成經(jīng)過中起到關(guān)鍵作用。miRNA和piRNA都在調(diào)節(jié)雄性生殖細(xì)胞分化經(jīng)過中起到重要作用。2sncRNA的構(gòu)造與功能2.1miRNA的構(gòu)造與功能miRNA是一種約19-25nt長(zhǎng)度的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在動(dòng)物睪丸的發(fā)育成熟、生殖細(xì)胞的功能分化以及精子發(fā)生經(jīng)過中發(fā)揮著重要作用[11].miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，主要由基因間隔區(qū)、內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)錄而來[9].這一類sncRNA的表示出具有組織特異性，但在不同生物體又表現(xiàn)出較高的同源性。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表示清楚，miRNA可能是不同類型的組織細(xì)胞調(diào)控基因表示出的重要元件，尤其是在睪丸組織中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對(duì)精子的發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的mRNA都是miRNA的保守靶位，主要是通過與轉(zhuǎn)錄修飾后mRNA的3UTR區(qū)結(jié)合來在抑制mRNA翻譯，與mRNA的作用結(jié)合部分高達(dá)2-7個(gè)核苷酸;這類sncRNAs與編碼蛋白的基因間有著較大的關(guān)聯(lián)性，由于很多基因編碼蛋白都會(huì)遭到miRNA途徑的調(diào)控[12].在miRNA的調(diào)控機(jī)制中其表示出與相關(guān)因子呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Bj?rk等[13]發(fā)如今睪丸組織中高富含miR-18,精子構(gòu)成經(jīng)過中它的表示出與熱休克因子2〔HSF2〕的表示出呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，曲精小管中抑制miR-18的表示出會(huì)導(dǎo)致HSF2蛋白水平增加、調(diào)控HSF2靶基因的表示出。在精子構(gòu)成經(jīng)過中，很多組織怎樣利用miRNAs來控制基因的表示出，miRNA通路中miRNAs的調(diào)控作用和靶位結(jié)合，當(dāng)前這一系列的詳細(xì)機(jī)制尚未明確;只是在圓形精細(xì)胞的擬染色體上發(fā)現(xiàn)了miRNA和miRNA相關(guān)蛋白，miRNA途徑中其他組件蛋白在擬染色體外。miRNA的編碼序列在基因組中全部能夠找到，但將近50%位于內(nèi)含子區(qū)[14].miRNA的生成主要是由這部分序列編碼的，構(gòu)成初始miRNA〔pri-miRNA〕后經(jīng)加工成為前體miRNA〔pre-miRNA〕，最后剪切成為成熟的miRNA.pri-miRNA由miRNA相應(yīng)的基因序列在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄構(gòu)成的產(chǎn)物，此時(shí)在核內(nèi)的pri-miRNA具有一個(gè)長(zhǎng)的發(fā)卡莖環(huán)構(gòu)造，發(fā)卡尾部還有兩條單鏈;然后被雙鏈RNA核酸內(nèi)切酶Drosha切割構(gòu)成pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)[5,10,16,17],pre-miRNA此時(shí)的構(gòu)造與pri-miRNA相比是丟失了發(fā)卡尾部的單鏈。細(xì)胞質(zhì)中pre-miRNA的莖環(huán)區(qū)在內(nèi)切核酸酶Dicer的作用下切除，構(gòu)成成熟的miRNA,此時(shí)miRNA仍然具有前體的發(fā)卡樣構(gòu)造，只是失去了莖環(huán)。隨后進(jìn)入一個(gè)具有AGO蛋白的核糖蛋白復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體是miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體〔miRISC〕，在mRNA翻譯中起到靶位錨定作用[16].mRNA被鎖定與否主要根據(jù)AGO蛋白的類型和mRNA與miRNA的互補(bǔ)程度[16,17].例如，哺乳動(dòng)物AGO蛋白家族中的AGO2是唯一能裂解RNA的成員，它能在mRNA-miRNA高度互補(bǔ)配對(duì)的情況下與mRNA結(jié)合并使其降解[16-18].然而，與miRNA互補(bǔ)性較低或者完全不互補(bǔ)配對(duì)的mRNA被以為是封存在細(xì)胞質(zhì)顆粒內(nèi)或是翻譯抑制。通過miRNA引起的翻譯抑制機(jī)制已經(jīng)被提出，miRNA能立即對(duì)mRNA的poly-A尾巴進(jìn)行脫腺苷化，避免poly-A綁定蛋白結(jié)合而發(fā)生有效翻譯[19].除此之外，AGO2綁定在修飾過的mRNA的5端，與真核起始因子4E〔eIF4E〕競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而阻止翻譯起始[20],同時(shí)eIF6阻止功能型核糖體80s亞基的構(gòu)成[21].另一方面，miRNA也能促進(jìn)翻譯的發(fā)生，但是僅限于細(xì)胞處于增殖狀態(tài)或mRNA靶位的3UTR富含腺嘌呤和鳥嘌呤核糖核苷酸。在小鼠發(fā)育早期階段，讓小鼠條件性的失去Drosha或Dicer酶類，精子構(gòu)成會(huì)被阻斷，由此睪丸中miRNA功能機(jī)制的研究對(duì)精子發(fā)育特別重要。通過部分純化的生殖細(xì)胞或是整個(gè)睪丸組織的表示出形式研究發(fā)現(xiàn)，小鼠或人類的睪丸中都有其特有的miRNA類群[22-31],華而不實(shí)已發(fā)現(xiàn)部分介入哺乳動(dòng)物精子的構(gòu)成。2.2piRNA構(gòu)造與功能正如前面所提到的，sncRNA的生物學(xué)功能對(duì)精子的構(gòu)成經(jīng)過至關(guān)重要。piRNA是另一類內(nèi)源性sncRNA,其核苷酸長(zhǎng)度為24-30個(gè)左右，它的產(chǎn)生不依靠Dicer酶，而是與piwi蛋白作用[30].隨著物種不斷的進(jìn)化，piRNA基因序列具有較低的保守性，但這類分子仍有活性，在果蠅中，piRNAs主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，編碼piRNAs的基因主要位于基因組重復(fù)區(qū)域的轉(zhuǎn)座元件中，piwi通路在精子構(gòu)成經(jīng)過中有沉默逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特定作用[31,32].在哺乳動(dòng)物中，區(qū)別于果蠅，piRNAs主要富集在雄性生殖系，且編碼piRNAs基因序列主要存在于不含有轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列的未注釋的基因間區(qū)域內(nèi)[33].然而，當(dāng)前對(duì)于起源于轉(zhuǎn)座元件外的piRNAs的功能仍然未知。有實(shí)驗(yàn)表示清楚，轉(zhuǎn)座子的控制與精子的發(fā)生有關(guān)，有利于保衛(wèi)遺傳信息的穩(wěn)定傳遞[34-36].缺乏piwi通路元件的