基因的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系

理論與實踐周建偉當(dāng)前1頁，總共127頁。認(rèn)識基因的結(jié)構(gòu)和功能

理論基礎(chǔ)當(dāng)前2頁，總共127頁。真核和原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯當(dāng)前3頁，總共127頁。當(dāng)前4頁，總共127頁。15Feb2001

TheSangerCentre,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SA,UK

16Feb2001CeleraGenomics,45

WestGudeDrive,Rockville,MD20850,

USA

值得紀(jì)念的里程碑，人類首次解密自身的基因密碼當(dāng)前5頁，總共127頁?？茖W(xué)家對DNA含義的理解當(dāng)前6頁，總共127頁?？茖W(xué)家對DNA含義的理解當(dāng)前7頁，總共127頁?？茖W(xué)家對DNA含義的理解當(dāng)前8頁，總共127頁?？茖W(xué)家對DNA含義的理解當(dāng)前9頁，總共127頁。蛋白質(zhì)的相互作用當(dāng)前10頁，總共127頁。HGP的完成為探索基因功能打下了堅實的基礎(chǔ)當(dāng)前11頁，總共127頁。候選基因

（CandidateGenes）全基因組關(guān)聯(lián)學(xué)研究

（Genome-wideAssociationStudy）生物學(xué)通路研究

（Pathway-basedGenes）當(dāng)前12頁，總共127頁。

機體易感性對環(huán)境因素致癌的影響當(dāng)前13頁，總共127頁?；颉硇吐?lián)系的復(fù)雜性當(dāng)前14頁，總共127頁。當(dāng)前15頁，總共127頁。當(dāng)前16頁，總共127頁。當(dāng)前17頁，總共127頁。當(dāng)前18頁，總共127頁。當(dāng)前19頁，總共127頁。當(dāng)前20頁，總共127頁。JWA基因的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究：實踐探索

當(dāng)前21頁，總共127頁。

建立誘導(dǎo)細(xì)胞分化模型，克隆調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，解析基因結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系，發(fā)展基于機制研究的基因干預(yù)手段科研思路當(dāng)前22頁，總共127頁。

惡性腫瘤是危害人類健康最主要的疾病之一，大多數(shù)惡性腫瘤是由環(huán)境因素和基因交互作用所致惡性腫瘤的生物學(xué)特征包括無限增殖、分化和凋亡障礙、浸潤以及轉(zhuǎn)移當(dāng)前23頁，總共127頁。

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤威脅生命的最主要原因細(xì)胞遷移是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的必備條件對腫瘤細(xì)胞遷移及其調(diào)控機制的研究已成為腫瘤預(yù)防和治療領(lǐng)域的熱點

RidleyAJ.,etal.Science.2003;302(5651):1704-1709CondeelisandPollard.Cell.2006;124:263-266當(dāng)前24頁，總共127頁。

細(xì)胞的各種生物學(xué)行為是由細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)分子按信號通路執(zhí)行完成的絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)最主要的信號通路之一，可介導(dǎo)多種細(xì)胞生物學(xué)行為在細(xì)胞遷移過程中,MAPK信號通路起重要調(diào)節(jié)作用

RaftopoulouM.NatureCellBiology.2006;8,654HuangC,etal.JorunalofCellScicence.2004;117(20):4619-4628HashiramotoA.etal.Oncogene.2006;25,3948–3955當(dāng)前25頁，總共127頁。MAPKSignalPathway環(huán)境因素刺激細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如MAPK磷酸化激活下游靶分子生物學(xué)效應(yīng)增殖分化凋亡遷移當(dāng)前26頁，總共127頁。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般規(guī)律當(dāng)前27頁，總共127頁。JWA基因

由我本人1997年發(fā)現(xiàn)和克隆，1998年獲GenBank新基因號：AF0705232002年HUGO把JWA正式命名為ARL6IP5；GenBank中的其它別名：GTRAP3-18;PRAF3;jmx等

JWA在人染色體定位是3p14;cDNA全長為2.1kb,其編碼蛋白定位于細(xì)胞漿，含188個氨基酸

JWA在生物進(jìn)化中保守當(dāng)前28頁，總共127頁。JWA基因庫文件大鼠JWA基因庫文件課題組登錄在GenBank的人和大鼠JWA基因序列當(dāng)前29頁，總共127頁。JWA↓HUGO正式批準(zhǔn)JWA及其同源基因的基因名為ARL6IP5當(dāng)前30頁，總共127頁。

JWA基因的染色體定位當(dāng)前31頁，總共127頁。

人類3號染色體的基因構(gòu)成和特點當(dāng)前32頁，總共127頁。

人、小鼠、大鼠JWA基因染色體定位對應(yīng)關(guān)系當(dāng)前33頁，總共127頁。JWA同源基因DNA和蛋白質(zhì)相似性人>黑猩猩>犬>小鼠>大鼠>雞>斑馬魚>果蠅>蚊>線蟲當(dāng)前34頁，總共127頁。LOCUSAAC64360188aaDEFINITIONJWAprotein[Homosapiens].AUTHORSZhou,J.W.,Di,Y.P.andWu,R.TITLEAnoveldifferentiallydisplayedvitaminAresponsivegenethatiscytoskeletonrelated

JOURNALSubmitted(02-JUN-1998)InternalMedicine,UCatDavis,Rm1121,SurgeI,CCRBM,UCDavis,Davis,CA95616,USAMDVNIAPLRAWDDFFPGSDRFARPDFRDISKWNNRVVSNLLYYQTNYLVV50AAMMISIVGFLSPFNMILGGIVVVLVFTGFVWAAHNKDVLRRMKKRYPTT100FVMVVMLASYFLISMFGGVMVFVFGITFPLLLMFIHASLRLRNLKNKLEN150KMEGIGLKRTPMGIVLDALEQQEEGINRLTDYISKVKE188

OpenReadingFrame(ORF)ofJWA

PKCphosphorylationsites:SDR,SLRThreetransmembranedomains

當(dāng)前35頁，總共127頁。氨基端在膜外側(cè)，羧基端在膜內(nèi)側(cè)；第一個跨膜區(qū)為一級螺旋結(jié)構(gòu)，第二和第三個跨膜區(qū)為二級螺旋結(jié)構(gòu)；兩個PKC磷酸化位點分別在膜兩側(cè)；第一個跨膜區(qū)為一級螺旋結(jié)構(gòu)，第二和第三兩個跨膜區(qū)為二級螺旋結(jié)構(gòu)。

當(dāng)前36頁，總共127頁。JWA蛋白磷酸化基序預(yù)測當(dāng)前37頁，總共127頁。97年以來，課題組對JWA基因結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究取得一系列創(chuàng)新性成果

圍繞JWA應(yīng)答環(huán)境理化因素（H2O2、熱休克、UV），著重研究：

JWA應(yīng)答細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)DNA堿基切除修復(fù)（BER）調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用和機制圍繞JWA是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞分化，著重研究：

JWA調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移/細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、浸潤體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用和機制1997？？當(dāng)前38頁，總共127頁?！獭獭獭獭獭獭坍?dāng)前39頁，總共127頁。JWA基因與細(xì)胞凋亡當(dāng)前40頁，總共127頁。JWA表達(dá)是As2O3通過活性氧-線粒體信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的必需分子

當(dāng)前41頁，總共127頁。As2O3

誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡與JWA表達(dá)相平行HeLaCellMCF-7Cell當(dāng)前42頁，總共127頁。

JWA表達(dá)是As2O3抗增殖和促凋亡作用的必需條件HeLaCellMCF-7Cell當(dāng)前43頁，總共127頁。下調(diào)JWA表達(dá)

阻止

As2O3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用依賴于caspase-9表達(dá)當(dāng)前44頁，總共127頁。下調(diào)JWA表達(dá)抑制As2O3

對線粒體膜電位的影響

C1-HeLa

As-HeLa當(dāng)前45頁，總共127頁。As2O3

產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)JWA表達(dá)當(dāng)前46頁，總共127頁。JWA激活MEK–ERK1/2和JNK分子的磷酸化當(dāng)前47頁，總共127頁。JWA與腫瘤細(xì)胞凋亡—小結(jié)As2O3產(chǎn)生的H2O2通過誘導(dǎo)JWA表達(dá)觸發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡JWA為As2O3誘導(dǎo)活化MEK–ERK和JNK所必需，進(jìn)一步影響線粒體膜電位并激活casepase-9，從而在As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮中心作用As2O3誘導(dǎo)Bad活化與細(xì)胞凋亡有關(guān)，也受JWA調(diào)節(jié)，但與MEK–ERK/JNK機制無關(guān)當(dāng)前48頁，總共127頁。ZhouJ.,etal.ToxicolApplPharmacol,2008,230:33-40當(dāng)前49頁，總共127頁。JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激的分子機制當(dāng)前50頁，總共127頁。XRCC1,PolAPE1,LigIII,PARP-1未修復(fù)DNA修復(fù)維護(hù)基因組穩(wěn)定癌癥SIRT6BER通路基因組不穩(wěn)定DNA損傷DNA損傷Cell,2006Nature,2008衰老ROS損傷嚴(yán)重修復(fù)能力缺陷當(dāng)前51頁，總共127頁。問題的提出JWA應(yīng)答細(xì)胞的氧化應(yīng)激？——是否應(yīng)答？如何應(yīng)答？當(dāng)前52頁，總共127頁。SOD:catalase:O-2.

O-2.

H2O2

H2O2

O2O-2.

H2O2

H2OcatalaseSOD細(xì)胞中活性氧代謝規(guī)律當(dāng)前53頁，總共127頁。通過靶基因起效應(yīng)ROS或自由基激活轉(zhuǎn)錄因子激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK通路等NF-B、AP-1等清除ROS修復(fù)細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激作用于細(xì)胞的過程和轉(zhuǎn)歸當(dāng)前54頁，總共127頁。JWA參與B(a)P誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)1.control2.DMSO3.10μM4.50μM5.100μMβ-actinJWAhsp701234550McontrolDMSO10M100M3h24h損傷修復(fù)當(dāng)前55頁，總共127頁。A3A2B1B2B3A2CtrlB(a)PnoenzymeFPGEndoIIIB(a)P代謝產(chǎn)物暴露使細(xì)胞形成8-OH-dG當(dāng)前56頁，總共127頁。H2O2H2O2+EndoⅢH2O2+FPG00.010.101.00H2O2(mmol/L)ABCEFGHJKLDIH2O2所致細(xì)胞DNA損傷和8-OH-dG的形成當(dāng)前57頁，總共127頁。

Lane

123456AJWAβ-actin1530606060minctrlH2O2SOD-

---+-catalase-

----+

Lane1234567Bβ-actinJWAB(a)Pctrl4812242424hrSOD-

---

-

+-catalase-

---

-

-+胞內(nèi)H2O2自由基誘導(dǎo)JWA的表達(dá)當(dāng)前58頁，總共127頁。untreatedH2O2H2O2+SODH2O2+catalaseO-2.level(DE)H2O2level(DCFH-DA)H2O2處理后細(xì)胞內(nèi)O-2.和H2O2變化(活性氧染色實驗)當(dāng)前59頁，總共127頁。untreatedB(a)PB(a)P+SODB(a)P+catalaseO-2.level(DE)H2O2level(DCFH-DA)B(a)P處理后細(xì)胞內(nèi)O-2.和H2O2變化(活性氧染色實驗)當(dāng)前60頁，總共127頁。篩選轉(zhuǎn)錄活性最強的啟動子區(qū)域(報告基因模型)

600bpS1S2S3S4S5S6M300bp100bp2143013646017021587ALUC(-194/+107)LUC(-257/+107)LUC(-494/+107)LUC(-595/+107)LUC(-1680/+107)LUC(+21/+107)LUC(-107/+107)relativeluciferaseactivity當(dāng)前61頁，總共127頁。B123456789ctrlH2O2B(a)Pprobe-107/-28wt核因子與轉(zhuǎn)錄活性最強的啟動子區(qū)域結(jié)合(凝膠阻滯實驗)

當(dāng)前62頁，總共127頁。證實該核因子的分子量為～47kD(Southwestern實驗)

ctrlH2O2B(a)P-107/+107wtprobe47kDC當(dāng)前63頁，總共127頁。CBF?NF1?

CEBP?GATA-1?H2O2和B(a)P共同激活的轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)前64頁，總共127頁。DctrlH2O2B(a)PNF1/CTFAb47kD證實該核因子可能為NF1(1)(Westernblot實驗)

當(dāng)前65頁，總共127頁。核因子為NF1(2)(Supershift實驗)

B(a)PH2O2-107/-28wtprobe--+-+NF1AbFreeprobeprobe+proteinprobe+protein+Abprobe+proteinprobe+protein+AbE當(dāng)前66頁，總共127頁。FctrlH2O2B(a)P-107/+107wtprobe65kDctrlH2O2B(a)PNF1/CTFAb65kD進(jìn)一步證實該核因子為NF1(3)(免疫沉淀實驗)

nuclearextractsNF1antibodyProteinADIG-labeled-107/+107ProbeWesternblot當(dāng)前67頁，總共127頁。干涉NF1可有效阻斷H2O2和B(a)P誘導(dǎo)的JWA轉(zhuǎn)錄活性(1)

Grelativeluciferaseactivity當(dāng)前68頁，總共127頁。干涉NF1后阻斷了H2O2和B(a)P誘導(dǎo)的JWA表達(dá)(2)(RNAi實驗)

Lane

1234JWAβ-actinNF1H2O2

--+-NF1siRNA-+++B(a)P---+HWesternblot當(dāng)前69頁，總共127頁。-94/-90-53/-49CCAATboxCCAATbox-107-28CBF×NF1

CEBP×GATA-1×

??JWA啟動子區(qū)有兩個NF1結(jié)合元件當(dāng)前70頁，總共127頁。A制備CCAAT變異探針用于檢測其與NF1結(jié)合

①××②③④當(dāng)前71頁，總共127頁。ctrlH2O2B(a)PCTF1(-107/-59)probeCTF2(-58/-9)CTF1+2(-97/-44)CTFm1+2(-97/-44)47kDBNF1與第二個CCAAT元件結(jié)合(1)(Southwestern實驗)

①②③④當(dāng)前72頁，總共127頁。C-58/-9123456789ctrl

H2O2B(a)Pprobe-107/-59123456789ctrl

H2O2B(a)PprobeNF1與第二個CCAAT元件結(jié)合(2)(凝膠阻滯實驗)

當(dāng)前73頁，總共127頁。NF1與第二個CCAAT元件結(jié)合(3)(定點突變實驗)

LUCLUCLUCD當(dāng)前74頁，總共127頁。NormalKD-JWAβ-actinJWA12ABVector-ctrlHeLaKD-JWAHeLacontrolB(a)P3hRe-3h123456JWA保護(hù)氧化應(yīng)激引起的DNA損傷

損傷修復(fù)當(dāng)前75頁，總共127頁。JWA通過調(diào)節(jié)BER信號通路參與DNA修復(fù)當(dāng)前76頁，總共127頁。JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激--小結(jié)JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2通過NF1與JWA啟動子區(qū)CCAAT元件結(jié)合后激活JWA表達(dá)JWA進(jìn)一步通過BER信號通路促進(jìn)DNA修復(fù)當(dāng)前77頁，總共127頁。ChenR.,etal.FreeRadicBiolMed,2007,42:1704當(dāng)前78頁，總共127頁。作為細(xì)胞氧化應(yīng)激條件下的應(yīng)答基因，JWA如何保護(hù)細(xì)胞拮抗氧化損傷？作為還原性蛋白直接中和細(xì)胞內(nèi)活性氧？作為DNA修復(fù)蛋白修復(fù)DNA損傷？進(jìn)一步的問題當(dāng)前79頁，總共127頁。JWA作為還原性蛋白直接中和

細(xì)胞內(nèi)活性氧？JWA缺陷細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加？使細(xì)胞回復(fù)表達(dá)JWA后細(xì)胞內(nèi)活性氧含量減少？當(dāng)前80頁，總共127頁。

實驗結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)JWA表達(dá)水平不影響活性氧含量——JWA可能不是直接的還原性蛋白

JWA作為DNA修復(fù)蛋白修復(fù)DNA損傷？當(dāng)前81頁，總共127頁。實驗?zāi)Ｐ蚇IH-3T3HELF氧化損傷模型：氧化損傷MMSH2O2損傷修復(fù)模型：氧化損傷除去氧化劑加入新鮮培養(yǎng)液修復(fù)H2O2：HydrogenPeroxide,過氧化氫MMS:methylmethanesulfonate,甲磺酸甲酯當(dāng)前82頁，總共127頁。JWA參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)當(dāng)前83頁，總共127頁。UntreatedplasmidH2O2damagedplasmid宿主細(xì)胞活性實驗當(dāng)前84頁，總共127頁。細(xì)胞中JWA的表達(dá)增強DNA損傷修復(fù)能力

當(dāng)前85頁，總共127頁。JWA低表達(dá)的細(xì)胞對氧化劑造成的損傷更加敏感MTT實驗當(dāng)前86頁，總共127頁。JWA低表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出氧化損傷更加嚴(yán)重檢測細(xì)胞中NAD(P)H水平當(dāng)前87頁，總共127頁。免疫共沉淀AB當(dāng)前88頁，總共127頁。JWA作為BER復(fù)合物中新的修復(fù)分子CD當(dāng)前89頁，總共127頁。JWA調(diào)節(jié)XRCC1和LigIII的表達(dá)而不影響APE1的表達(dá)當(dāng)前90頁，總共127頁。ABC氧化損傷引起JWA的核移位當(dāng)前91頁，總共127頁。DE敲減JWA抑制XRCC1進(jìn)核當(dāng)前92頁，總共127頁。氧化損傷誘導(dǎo)JWA漿核易位F當(dāng)前93頁，總共127頁。XRCC1對JWA的漿核易位起重要的作用AB當(dāng)前94頁，總共127頁。B12H2O2

通過E2F1調(diào)節(jié)XRCC1轉(zhuǎn)錄

JWA影響H2O2

對XRCC1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)當(dāng)前95頁，總共127頁。DCProbe：5’-TAATTTTTTTCGCGCGTGCGCGCGCGCGTA-3’–biotinCompetitorProbe：5’-TAATTTTTTTCGCGCGTGCGCGCGCGCGTA-3’JWA通過E2F1調(diào)節(jié)XRCC1的轉(zhuǎn)錄水平MutatedCompetitorProbe：5’-TAATTTTCG

AGC

TGCGTA

GACTCACGCGTA-3’當(dāng)前96頁，總共127頁。BJWA通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路影響E2F1的表達(dá)A當(dāng)前97頁，總共127頁。BA當(dāng)前98頁，總共127頁。JWA維持XRCC1的蛋白穩(wěn)定當(dāng)前99頁，總共127頁。敲減JWA加速泛素化酶對XRCC1的降解當(dāng)前100頁，總共127頁。JWA抑制XRCC1通過泛素-蛋白酶體途徑降解當(dāng)前101頁，總共127頁。GJWA表達(dá)不受泛素化影響當(dāng)前102頁，總共127頁。JWA與DNA堿基切除修復(fù)—小結(jié)氧化應(yīng)激激活的JWA通過MAPK-E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)XRCC1及其下游分子表達(dá)，啟動細(xì)胞應(yīng)答氧化應(yīng)激機制JWA與XRCC1相互調(diào)節(jié)核內(nèi)表達(dá)量，協(xié)調(diào)DNA氧化損傷后的BER修復(fù)過程JWA通過泛素化途徑調(diào)控核內(nèi)XRCC1的表達(dá)量當(dāng)前103頁，總共127頁。①②③④H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)BER信號通路的機制當(dāng)前104頁，總共127頁。WangSY,etal.NucleicAcidsRes.2009,37(6):1936-1950當(dāng)前105頁，總共127頁。進(jìn)一步的問題細(xì)胞JWA表達(dá)水平是否影響其抵抗環(huán)境因素的損傷作用？細(xì)胞JWA表達(dá)水平與腫瘤易感性關(guān)系？JWA與XRCC1的相互調(diào)節(jié)關(guān)系與腫瘤發(fā)生發(fā)展？當(dāng)前106頁，總共127頁。-76GG-76GC-76GC-76GG-76GC-76GGJWA基因-76GC多態(tài)性增加胃癌和食管癌易感性TangWY,JTEH,2007當(dāng)前107頁，總共127頁。JWASNP-76G>CJWA應(yīng)答氧化應(yīng)激能力

腫瘤危險性

JWA基因的SNPs與腫瘤易感性有關(guān)病例/對照=1096/814CombinedOR=1.85(1.15-2.81)BDC膀胱癌胃癌食管癌白血病A當(dāng)前108頁，總共127頁。當(dāng)前109頁，總共127頁。JWA和XRCC1用于預(yù)測胃癌患者術(shù)后預(yù)后以及指導(dǎo)個體化治療當(dāng)前110頁，總共127頁。2023/3/19111JWA基因在人胃癌和癌旁組織中的表達(dá)JWAXRCC1當(dāng)前111頁，總共127頁。2023/3/19112胃癌組織中JWA和/或XRCC1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系當(dāng)前112頁，總共127頁。2023/3/19113胃癌組織中JWA或XRCC1表達(dá)對化療效果的影響當(dāng)前113頁，總共127頁。2023/3/19114配對癌旁組織中JWA/XRCC1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系當(dāng)前114頁，總共127頁。ⅠⅡTNMI-II期單純手術(shù)胃癌患者術(shù)后生存當(dāng)前115頁，總共127頁。TNMIII-IV期單純手術(shù)胃癌患者術(shù)后生存ⅢⅣJWAhighJWAlowN=423,p<0.001020406080100Cum.Survival(%)020406080100120Time(m