儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案學(xué)生姓名：張碧柳學(xué)號(hào)：20122401144學(xué)生姓名：黎初文學(xué)號(hào)：20122401158課程名稱(chēng)：化學(xué)儀器分析實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：探究性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定（紫外-可見(jiàn)分光光度法）【摘要】以a-萘胺為顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)定了從超市買(mǎi)來(lái)的熏肉制品中亞硝酸鹽的含量。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了實(shí)驗(yàn)的最佳條件:酸度、顯色劑的用量和顯色時(shí)間。【關(guān)鍵詞】肉制品;亞硝酸鹽;紫外-可見(jiàn)分光光度法【引言】亞硝酸鹽用于肉類(lèi)食品中作為發(fā)色劑。在食品加工過(guò)程中，添加適量的化學(xué)物質(zhì)與食品中的某些成分作用，從而使食品呈現(xiàn)良好的色澤，這樣的化學(xué)物質(zhì)成為發(fā)色劑。類(lèi)腌制品中最常有的發(fā)色劑是硝酸鹽，亞硝酸鹽以及發(fā)色助劑，抗環(huán)血酸、煙酰胺等。肉制品由于使用亞硝酸鹽而呈鮮紅色。亞硝酸鹽也是一種防腐劑，它可抑制微生物的增值，在食品工業(yè)生產(chǎn)中，原料內(nèi)的紅色是由肌紅蛋白及血紅蛋白所呈現(xiàn)的感官性狀。肌紅蛋白約占60%-70%，血紅蛋白占10%-30%，即肌紅蛋白是表現(xiàn)肉顏色的主要成分，新鮮肉中還原型的肌紅蛋白呈暗紫紅色，它很不穩(wěn)定，易被氧化而呈鮮紅的氧合肌紅蛋白，繼續(xù)氧化則成褐色高鐵肌紅蛋白，再繼續(xù)氧化呈黃色或綠色的氧化卟啉。在肉制品加工過(guò)程中，為了使肉類(lèi)食品呈鮮艷的紅色，添加硝酸鹽及亞硝酸鹽，在肉制品內(nèi)它們轉(zhuǎn)化為亞硝酸，并分解出亞硝基，生成的亞硝基會(huì)很快的與肌紅蛋白生成鮮艷亮紅色的亞硝基肌紅蛋白,亞硝基肌紅蛋白遇熱放出變成具有鮮紅色的亞硝基血色原,賦予食品鮮艷的紅色。亞硝酸鹽不僅具發(fā)色作用,同時(shí)對(duì)肉毒桿菌具有特殊的抑制作用,對(duì)提高肉類(lèi)食品的風(fēng)味有一定的功效,它們作為食品添加劑,對(duì)人體有一定的毒性,攝取過(guò)多亞硝酸鹽,可使血液中正常的血紅蛋白（二價(jià)鐵）變成正鐵血紅蛋白（三價(jià)鐵）而失去攜氧功能,導(dǎo)致神經(jīng)缺氧。由于肉制品生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中亂加、誤加亞硝酸鹽而引起食物中毒,所以強(qiáng)制檢驗(yàn)肉制品生產(chǎn)企業(yè)加入硝酸鹽與亞硝酸鹽的含量起到非常重要的作用。肉類(lèi)罐頭與肉制品最大使用量不得超過(guò)0.05克/公斤。除了肉類(lèi)食品含有硝酸鹽及亞硝酸鹽,果蔬制品、醬腌菜中也含有亞硝酸鹽。肉類(lèi)食品中亞硝酸鹽測(cè)定方法有很多種，以下是對(duì)幾種方法的簡(jiǎn)介：1、光度法光度法測(cè)定亞硝酸鹽占據(jù)了重要的地位。目前，光度法測(cè)定亞硝酸鹽的方法除經(jīng)典的格里斯試劑比色法及其改良法外，又有一些報(bào)道如催化（褪色）光度法流動(dòng)注射系統(tǒng)-分光光度法順序注射系統(tǒng)-分光光度法導(dǎo)數(shù)光度法等分光光度法主要有3種：可見(jiàn)分光光度法、紫外分光光度法、紅外分光光度法。2、示波極譜法示波極譜分析法是指在特殊條件下進(jìn)行電解分析以測(cè)定電解過(guò)程中所得到的電流-電壓曲線來(lái)做定量定性分析的電化學(xué)方法，示波極譜法是新的極譜技術(shù)之一，該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高適用范圍廣檢出限低和測(cè)量誤差小等優(yōu)點(diǎn)。示波極譜法的原理是將樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)去除脂肪后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，在弱堿性條件下再與8-羥基喹啉偶合成染料，該偶合染料在汞電極上還原產(chǎn)生電流，電流與亞硝酸鹽濃度成線性關(guān)系，可與標(biāo)準(zhǔn)曲線定量在示波極譜儀上采用三電極體系即以滴汞電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極進(jìn)行測(cè)定測(cè)定時(shí)要注意顯色條件的嚴(yán)格控制8-羥基喹啉溶液的配制及樣品的前處理采用單掃描示波極譜法測(cè)定香腸中的亞硝酸鹽的含量，測(cè)定結(jié)果與分光光度法測(cè)定的結(jié)果基本一致該法的檢測(cè)限為3x10-9g/mL3、熒光分析法熒光分析法是光譜分析法的一種熒光分析法的原理是亞硝酸鹽與過(guò)量的對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，剩余的對(duì)氨基苯磺酸與熒光胺作用，生成穩(wěn)定的熒光團(tuán)和無(wú)熒光的水解產(chǎn)物，在激發(fā)波長(zhǎng)436nm，熒光波長(zhǎng)495nm下其熒光強(qiáng)度與對(duì)氨基苯磺酸的量成正比,對(duì)氨基苯磺酸原始量與重氮化后過(guò)剩的對(duì)氨基苯磺酸的量的差值為與亞硝酸鹽發(fā)生重氮化反應(yīng)的對(duì)氨基苯磺酸的量，進(jìn)而算出亞硝酸鹽的含量該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好試樣用量小，且不受檢測(cè)液本身顏色和渾濁的干擾，也不受樣品稀釋度的影響；但是操作較為復(fù)雜，對(duì)環(huán)境因素敏感，

干擾因素較多，而且適用范圍不廣4、離子色譜法離子色譜法是液相色譜法的一種如離子色譜法同時(shí)測(cè)定蘋(píng)果汁中的亞硝酸鹽硝酸鹽和硫酸鹽的含量，提出了用離子色譜/電導(dǎo)檢測(cè)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。采用IonPacASll-HC陰離子交換分離柱30mg/L氫氧化鉀作流動(dòng)相，自動(dòng)再生抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器ASRS-4mm，該方法有良好的線性和重復(fù)性，相關(guān)系數(shù)為0.9996,相對(duì)偏差小于3%，回收率為97.0%5、其他檢測(cè)方法目前還有人將以下方法應(yīng)用于亞硝酸鹽的檢測(cè)：氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)血管電泳（CE）、催化動(dòng)力學(xué)法、氣相流動(dòng)分析一紅外檢測(cè)最常用的方法是鹽酸萘乙二胺法,也就是用分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度,分光光度法以其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作快捷、靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn),深受歡迎。本實(shí)驗(yàn)研究了以a-萘胺為顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定肉制品中的亞硝酸鹽的含量的方法。結(jié)果證明,此方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確,是一種食品檢測(cè)的好方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】自樣品中抽提分離出亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，此重氮鹽再與a-萘胺試劑發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物。其顏色的深度與樣液中亞硝酸含量成正比，可比色測(cè)定。反應(yīng)式如下：NO2-+H++H2NN=NNNO2-+H++H2NN=NNSO3h+SO3HNH2SO3H H2OSO3H NH2401mx x——mg/kg)肉制品中亞硝酸鹽含量==50050mg/kg)式中：X為由測(cè)得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（口g/mL）；

m為樣品質(zhì)量(g)。【試劑及儀器】1?試劑：2)(1)亞鐵氰化鉀溶液：稱(chēng)取10.619克亞鐵氰化鉀［K4Fe(CN)6?3H2O］溶于水,并稀釋至100mL2)乙酸鋅溶液：稱(chēng)取22.0克乙酸鋅［Zn(CH3COO)2?2H2O］，加3mL冰醋酸溶于水，并稀釋至100mL。(3)飽和硼砂溶液：5.0克硼酸鈉(Na2BO4?10H2O)溶于100mL熱水中，冷卻備用。對(duì)氨基苯磺酸溶液(0.4g/L)：稱(chēng)取2.4g對(duì)氨基苯磺酸溶于50mL20%鹽酸中，避光保存。0.2%a-萘胺溶液(2g/L)：稱(chēng)取l.OOOg鹽酸萘乙二胺，以水定容50mL,避光保存。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(200口g/mL)：精確稱(chēng)取0.1003克于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉(優(yōu)級(jí)純)，加水定容到500mL。亞硝酸鈉標(biāo)溶液(5口g/mL)：臨用前，吸取此溶液2.5ml于100ml容量瓶中，用水定容到100ml2?儀器：①研缽②UV8500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)③分析天平④1mL、2mL、5mL、20mL移液管各1支⑤50mL燒杯1個(gè)，100ml燒杯1個(gè)⑥10ml量筒1個(gè)，100ml量筒1個(gè)⑦500mL燒杯1個(gè)，500ml容量瓶4個(gè)⑧50mL容量瓶10個(gè)，100ml容量瓶4個(gè)⑨濾紙、過(guò)濾裝置一套⑩比色皿2個(gè)。【實(shí)驗(yàn)步驟】1、樣品處理樣品中硝酸鹽及亞硝酸鹽的提?。悍Q(chēng)取經(jīng)剁碎混合均勻的樣品5g于100mL燒杯中，加入硼砂飽和溶液12.5mL,以玻璃棒攪拌，然后用70°C左右的水約300mL,將其稀釋轉(zhuǎn)移到500mL容量瓶，沸水浴中加熱15分鐘，取出，轉(zhuǎn)動(dòng)，加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加5mL乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。冷卻到室溫，用水定容，搖勻。放置片刻，去除上層脂肪，清液用濾紙過(guò)濾，前30ml濾液棄之不用。2、最大吸收波長(zhǎng)的確定先用0.0000口g/mL的去離子水作為空白溶液也就是參比溶液進(jìn)行基線調(diào)零，調(diào)零后，把靠近外面的比色皿拿出換裝濃度為0.08口g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)610nm一450nm之間進(jìn)行掃描，求出最大吸收波長(zhǎng)3、 探究各個(gè)影響因素的最優(yōu)條件用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（5口g/mL）O.8ml于50ml的容量瓶中，各加水至約25m1,加入2ml0.4g/ml對(duì)氨基苯磺酸溶液（分別用15%、20%、25%的鹽酸溶解對(duì)氨基苯磺酸），搖勻，靜置3-5min后，各加入0.2%a-萘胺溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml）,并用水定容到50m1,搖勻，靜置（0、5、10、15、20、25min）后，用分光光度計(jì)在最大波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白。a、 酸度的影響保持其他條件固定不變，分別采用15%、20%、25%溶解對(duì)氨基苯磺酸調(diào)整待測(cè)溶液的酸度，經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度儀測(cè)其在540nm處的吸光度。做pH-吸光度曲線。b、 顯色劑用量的影響保持其他條件固定不變，分別用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml顯色劑a-萘胺溶液，經(jīng)紫外~可見(jiàn)分光光度儀測(cè)其在540nm處的吸光度。，作顯色劑用量-吸光度曲線。c、 顯色時(shí)間的影響保持其他條件固定不變，分別于加入顯色劑后0min、5min、10min、15min、20min、25min、測(cè)待測(cè)溶液在540nm處的吸光度，作顯色時(shí)間-吸光度曲線。4、 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（5ug/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0,1.5，2.0，2.5mL（各含0,1,2，3，4，5，7.5，10，12.5ug亞硝酸鈉）于一組50mL容量瓶中，各加水至約25mL，分別加2mL0.4g/m1對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置3—5min后，各加入1mL0.2%a-萘胺溶液，并用水定容到50mL,搖勻。（濃度分別為0.00,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.15,0.20,ug/ml）靜置15min后，用20mm比色皿，用分光光度計(jì)在最大波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白。以測(cè)得的各比色液的吸光度對(duì)應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線。。5、亞硝酸鹽的測(cè)定取40mL待測(cè)液于50mL容量瓶中，加1mL0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置3?5分鐘后，加入ImL02%a-萘胺溶液，定容，搖勻。比色測(cè)定，記錄吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度（Ug/mL），計(jì)算試樣中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的含量?！緦?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄計(jì)算與分析】最大吸收波長(zhǎng)的確定波長(zhǎng)/nm450460470480490500510520530540545吸光度波長(zhǎng)/nm548550552555560570580590600610吸光度2、酸度的選擇鹽酸含量15%20%25%吸光度3、顯色劑的用量體積/ml0.51.01.52.02.53.0吸光度4、顯色時(shí)間的影響時(shí)間/min0510152025吸光度5、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(確定最大波長(zhǎng)為 )亞硝酸鈉的體積/ml0.00.20.40.60.81.01.52.0吸光度6、待測(cè)溶液的吸光度和結(jié)果待測(cè)溶液吸光度【參考文獻(xiàn)】[1]杜紅霞,賀稚非,李洪軍.食品中亞硝酸鹽檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].肉類(lèi)研究.2006(01)[2]王丹.紫外分光光度法對(duì)肉制品中亞硝酸鹽化合物的測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,08:2213-2214.邱罡，陳宜菲.國(guó)內(nèi)光度法測(cè)定亞硝酸根進(jìn)展[J].光譜實(shí)驗(yàn)室.2010(03)郭金全，李富蘭.亞硝酸鹽檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].當(dāng)代化工,2009,05:546-549⑸衡朝暉.火腿腸中亞硝酸鹽的測(cè)定[J].浙江化工,2011,08:29-32.劉紅艷,宋秀環(huán),朱慧.紫外分光光度法測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2004,06:1119-1121.試劑清單1?試劑：10.619g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6?3H2O]22.0g