基因工程的基本操作步驟第1頁/共24頁獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因的表達(dá)基因工程基本操作步驟第2頁/共24頁一、獲得目的基因1、目的基因較小且序列已知——用化學(xué)方法直接人工合成。2、目的基因的全部或部分序列已知——用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（簡稱PCR）技術(shù)擴(kuò)增3、目的基因的序列是未知的——從基因文庫中獲取目的基因第3頁/共24頁②用某種限制酶切成多個片段①提取某種生物的DNA第一步：建立基因文庫（一般已做好）③將片段與載體連接起來④導(dǎo)入受體菌（常用大腸桿菌）群體中基因文庫第二步：從基因文庫中獲取目的基因⑤根據(jù)目的基因的產(chǎn)物等特性，用原限制酶將目的基因切下。第4頁/共24頁①用與切下目的基因的同種限制酶切開載體DNA二、形成重組DNA分子②用DNA連接酶連接目的基因和載體DNA，形成重組DNA分子。（重組質(zhì)?；蛑亟M病毒）第5頁/共24頁三、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞第6頁/共24頁構(gòu)建重組質(zhì)粒第7頁/共24頁四、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞在含有四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)目的基因抗四環(huán)素基因?qū)胫挥泻亟MDNA分子的細(xì)胞能生長抗四環(huán)素基因抗氨芐青霉素基因與目的基因兩側(cè)相同的酶切位點含目的基因第8頁/共24頁含四環(huán)素的培養(yǎng)基含氨芐青霉素的培養(yǎng)基含目的基因第9頁/共24頁五、目的基因的表達(dá)

受體細(xì)胞是原核細(xì)胞時，目的基因可留在質(zhì)粒上；受體細(xì)胞是真核細(xì)胞時，目的基因必須插入染色體DNA。第10頁/共24頁①檢測目的基因是否插入了受體細(xì)胞染色體DNA中——DNA分子雜交技術(shù)將DNA固定在膜上，加熱解旋將帶有放射性同位素標(biāo)記的含目的基因的DNA片段（探針，一般為單鏈）加到膜上提取受體細(xì)胞基因組DNA一段時間后沖洗檢測膜上是否有雜交帶（放射性）第11頁/共24頁第12頁/共24頁②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄——分子雜交技術(shù)固定在膜上的變成mRNA，探針與①相同③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原-抗體雜交④檢測生物個體是否出現(xiàn)相應(yīng)性狀第13頁/共24頁活動：完成“基因工程操作程序的模擬操作”思考：基因工程的理論基礎(chǔ)是什么？第14頁/共24頁原核生物界原生生物界植物界動物界真菌界第15頁/共24頁DNA的結(jié)構(gòu)和功能第16頁/共24頁轉(zhuǎn)錄翻譯遺傳信息的表達(dá)機(jī)制相同第17頁/共24頁整個生物界共用一套密碼子第18頁/共24頁二、基因工程的理論基礎(chǔ)DNA的結(jié)構(gòu)相同（雙螺旋結(jié)構(gòu)）DNA功能相同（即復(fù)制方式和表達(dá)機(jī)制相同）整個生物界共用一套密碼子哪些技術(shù)能保證基因工程能夠?qū)嵤?？?9頁/共24頁獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因的表達(dá)工具?限制酶DNA連接酶載體:質(zhì)粒、病毒第20頁/共24頁（3）蛋白組分析蛋白質(zhì)合成后，還要進(jìn)行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白質(zhì)剪切等翻譯后修飾，僅從核酸的序列并不能完全描述一個蛋白質(zhì)。盡管分析不同細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一個與基因組相對應(yīng)的名詞蛋白組分析的核心技術(shù)是蛋白質(zhì)雙向電泳。

技術(shù)上三大發(fā)明：（1）基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)——1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的自我復(fù)制能力，并能夠在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移?；蚴强梢赞D(zhuǎn)移的。（2）工具酶的發(fā)明——1972H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans從流感嗜血桿菌中分離得到限制性內(nèi)切酶；1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使真核細(xì)胞的基因制備成為可能；此后，多種限制酶和連接酶發(fā)現(xiàn)?；蚴强汕懈畹?。（3）DNA體外重組的實現(xiàn)——1972年，美Berg第一次構(gòu)建出了體外重組DNA分子。重組DNA表達(dá)實驗的成功——1973，H.Boyer&S.Cohen選用僅含單一EcoRI酶切位點的載體質(zhì)粒pSC101，使之與非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段重組。重組的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DNA中，轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA?；蚬こ陶Q生元年第21頁/共24頁技術(shù)進(jìn)一步推動基因工程的發(fā)展：（1）第一例轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物問世——1980科學(xué)家通過顯微注射培育出世界第一個轉(zhuǎn)基因小鼠。1983，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。（2）PCR技術(shù)的發(fā)明——1988年，美K.Mullis發(fā)明PCR技術(shù)，使基因工程進(jìn)一步發(fā)展。TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis

LaJolla,CA,USA第22頁/共24頁為了將上圖的目的基因與左圖的質(zhì)粒結(jié)合，應(yīng)該用_______限制酶切開質(zhì)粒，這是為了保證目的基因兩端與質(zhì)粒露出的________能夠堿基互補(bǔ)配對，之后在________作用下才能夠牢固結(jié)合，形成一個__________。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，受體細(xì)胞將獲得___________能力。EcoR.1切點Hand.3切點Taq.1切點抗四環(huán)素基因EcoR.1重組質(zhì)粒