掃描電鏡樣品制備的幾個(gè)問(wèn)題

臨界點(diǎn)干燥1.原理根據(jù)分子物理學(xué)，理想氣體的狀態(tài)方程為：將上式變換后即:在一定溫度下，有等溫線如圖。在不同溫度下的等溫線如圖。

圖中oa段，P隨的增加而增加，近似于理想氣體。ab段為氣液共存，壓強(qiáng)保持在飽和蒸汽壓.a點(diǎn)的密度為該溫度b點(diǎn)的密度為該溫度下氣液共存時(shí)的液體約密度。ab之間各點(diǎn)，表示氣液可以按比例共存，相當(dāng)?shù)闹荡碓摖顟B(tài)下相應(yīng)的密度。bd表示全部液化后，隨壓強(qiáng)的增加，密度僅有緩慢的增加，表明液體難以被壓縮。在不同溫度下，實(shí)際氣體的等溫線如圖所示。溫度較高(T3)時(shí)，近于理想氣體；溫度較低(T1,T2)時(shí)，有液化過(guò)程。溫度越低，液化過(guò)程越長(zhǎng)。溫度逐漸上升，液化過(guò)程越來(lái)越短，到達(dá)一定溫度，可縮短為0。在此溫度下，氣體到液體的轉(zhuǎn)變是突然的，兩者的密度相等，如圖中的c點(diǎn)。這一溫度稱(chēng)為臨界溫度(Tc)。c點(diǎn)的壓強(qiáng)，稱(chēng)為臨界壓強(qiáng)(Pc)。因此，物質(zhì)的臨界溫度就是對(duì)該物質(zhì)加壓時(shí)能液化的最高溫度。高于此溫度時(shí)，無(wú)論對(duì)該物質(zhì)施加多大壓強(qiáng)，它也不被液化。物質(zhì)的臨界壓強(qiáng)就是它在臨界溫度下，能被液化所需施加的最小壓強(qiáng)。低于此壓強(qiáng)，該物質(zhì)是氣體；高于此壓強(qiáng)是液體。在臨界狀態(tài)，界面消失，液氣共存，而且兩相的密度相等，表面張力等于零。若在此時(shí)干燥標(biāo)本，則標(biāo)本不會(huì)受表面張力的損傷。生物組織含有大量水，若于固定后在水的臨界狀態(tài)下進(jìn)行干燥，生物組織定遭破壞。目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室?guī)缀醵加肅02為工作介質(zhì)進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。

3.臨界點(diǎn)干燥失敗的原因臨界點(diǎn)干燥法固然是個(gè)好方法，但操作有誤也會(huì)失敗。常引起的原因如下：(1)C02量不夠；一般C02液體應(yīng)充至樣品室的50％一80％。若C02充量不夠，樣品室中的C02密度小于c，則升溫氣化時(shí)物態(tài)將沿c點(diǎn)左側(cè)的3’、4’、5’、6’豎直線變化。由3‘到4’不是液化而是氣化，到4點(diǎn)，全部變?yōu)闅怏w。這樣便不是臨界點(diǎn)干燥，而是類(lèi)似自然干燥。(2)樣品上粘附酯酸異戊酯過(guò)多；由于醋酸異戊酯不易揮發(fā)，C02氣體排出后，樣品室便留有殘余的醋酸異戊酯，因而干燥不充分。(3)樣品室封閉不嚴(yán)密；由于干燥前未擰緊放氣閥，或放氣閥橡皮墊圈不緊，或由于樣品室蓋橡皮墊圈老化等原因，導(dǎo)致樣品室不能密閉，使充入的CO2泄漏，其后果與I相同。(4)待干燥樣品量過(guò)大，這一方面把多量醋酸異戊酷帶入，另一方面盛樣品的小金屬盒在樣品室占據(jù)的空間過(guò)大，使C02量相對(duì)不足，因而干燥不充分。

二、真空干燥法樣品按普通掃描電鏡標(biāo)本制備方法進(jìn)行固定和乙醇系列脫水，然后將其由l00％乙醇移至100％乙醚中，再將樣品投入裝滿液氮的高約5cm的金屬杯中使之冷凍。把裝有冷凍樣品的金屬杯放入真空裝置中，用旋轉(zhuǎn)泵抽氣。由于在封閉空間體積不變的情況下，壓力降低會(huì)引起溫度下降，液氮變?yōu)楣虘B(tài)氮并且升華。然后樣品中的乙醇也升華，樣品干燥?？梢杂靡译娓稍飿?biāo)品，其步驟如下：樣品按一般方法固定，用濃度遞增的乙腈系列(50％一100％)脫水(每次脫水時(shí)間需20mln)。用容量約1m1的鋁制容器裝滿乙腈，把已脫水的樣品放入。將該容器放入真空裝置中。抽真空，容器驟冷，乙腈成為固態(tài)。繼續(xù)抽真空時(shí)乙腈升華。樣品干燥。

四、樣品的冷凍處理為了減少冰晶對(duì)組織的損傷，在冷凍前可用冷凍保護(hù)劑處理標(biāo)本。冷凍保護(hù)劑有PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、甘油、蔗糖、二甲基亞砜等，各有優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同組織選用不同的濃度和處理時(shí)間，PVP用15％一20％，甘油用20％一30％，二甲基亞礬用20％一30％，蔗糖用(0．5—2.3Mol／L。實(shí)際上蔗糖主要是使生物織織部分脫水而減少冰晶。處理時(shí)間10—30min由于液氮的冰點(diǎn)及沸點(diǎn)很接近。當(dāng)組織塊進(jìn)入液氮中時(shí)，最先接觸到組織的液氮溫度升高而氣化，致使組織塊表面被一層氣泡層包圍，起到絕熱層的作用，這反而大大降低冷凍速度，影響結(jié)構(gòu)的保存，因此不常用。(1)利用金屬材料的良好才熱性能，預(yù)先將金屬塊放入液氮中冷卻，待冷到與液氮相同的溫度后，將小塊組織與金屬面接觸而使其迅速冷凍，由于避免了液氮絕熱層的影響，故冷凍效果較好。與組織接觸的金屬表面要求持別光潔，另外，組織與金屬相互接觸時(shí)的壓力、速度也要控制好，否則會(huì)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)受形。常用的組織導(dǎo)電法：(1)單寧酸—餓酸法：將經(jīng)過(guò)常規(guī)取材固定的樣品，放進(jìn)2％單寧酸或該液與4％戊二醛混合液中2—12h，期間換液二次，漂洗后將樣品放人2％一4％餓酸中30min至數(shù)小時(shí)，經(jīng)梯度脫水、臨界點(diǎn)干燥處理，SEM觀察。（2）硫卡巴肼—餓酸法(OTO)法)：樣品取材后．用1％娥酸固定30一60min。經(jīng)充分漂洗，將樣品浸泡于硫卡巴肼二氨基硫脲過(guò)飽和水溶液10—30min，水洗15min(重復(fù)2—3次)以后，再次用1％餓酸液固定30—60min。最后脫水、干燥。(3)

碘化鉀一醋酸鉛組織導(dǎo)電處理①將組織用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?，并將多余的固定液清洗掉。②將組織轉(zhuǎn)入0.2％(W／V)碘化鉀(含0．2克碘)溶液中，于室溫下處理2分鐘。③用重蒸餾水清洗組織3次，每次1分鐘。④將組織轉(zhuǎn)入臨用前以3倍蒸餾水稀釋并過(guò)濾的0．4％(W／V)氫氧化鈉、0．12％(w／V)醋酸鉛水镕液中，于室溫下處離3分鐘。⑤用重蒸餾水洗去多余的混合镕液。⑥按常規(guī)程序脫水、臨界點(diǎn)干燥、噴鍍導(dǎo)電層。六、戊二醛的純化戊二醛是—種五碳醛，含有兩個(gè)醛基。30％以上濃度的戊二醛易聚合，市售的戊二醛通常為25％或50％的水溶液，含有較多雜質(zhì)。新處理過(guò)的戊二醛為無(wú)色或很談的黃色。對(duì)純戊二醛(戊二醛單體)進(jìn)行紫外分光測(cè)定時(shí)吸收峰為280nm。長(zhǎng)期存放的戊二醛可發(fā)生聚合，產(chǎn)生雜質(zhì),由于戊二醛中的醛基易氧化為有機(jī)酸，使pH下降。當(dāng)pH下降至3.5以下時(shí)，就失去固定能力，需要純化。純化的方法有蒸餾及用活性炭處理等方法。1.活性炭提純的方法是在市售的戊二醛溶液中按每l0㎜L／1g的比例加入活性炭，在4℃下?lián)u動(dòng)1h以上，然后過(guò)濾。測(cè)pH，在pH4以上即可使用。如pH在4以下、可用活性炭重復(fù)吸附2次。2.此外，還可用碳酸鋇吸附法提純，做法是100m1戊二醛中加2g碳酸鋇，搖動(dòng)5—10min，然后過(guò)濾備用。3.低壓蒸餾法(壓差10-17mmHg，溫度60－800C)可以得到很純的戊二醛蒸餾物。這種純的蒸餾物極不穩(wěn)定，必須立即用適當(dāng)體積的煮沸過(guò)的重蒸水在磁力攪拌器上(70－800C)稀釋成50％或25％的水溶液避光低溫保存。低壓蒸餾裝置如圖。1．參照?qǐng)D組裝減壓蒸餾裝置，但還須在盛干燥劑的干燥瓶出口加裝一封閉式水銀壓力計(jì)，用來(lái)測(cè)量干燥瓶?jī)?nèi)氣壓。2．將待處理戊二醛例入圓底燒瓶，放入沸珠數(shù)粒，3．開(kāi)啟水管，使之進(jìn)入冷凝管進(jìn)水口。4．接通電源，開(kāi)始加熱。5．開(kāi)啟真空泵，抽氣。6．觀察磨口溫度計(jì)，開(kāi)始蒸餾收集的是水，當(dāng)溫度達(dá)650C左右時(shí)，停止加熱，打開(kāi)排氣管待壓力平衡后，關(guān)閉真空泵，并取下接收瓶。7．取另一接收瓶，內(nèi)裝煮沸冷卻的雙蒸水(20一25m1)，放一小攪拌于，裝好后，接通加熱電源、真空泵電源及開(kāi)啟磁力攪拌器。當(dāng)溫度為70℃左右，裝置內(nèi)壓力為10mmHg條件下，蒸餾后收集物