豬丹毒桿菌的檢驗(yàn)分析第1頁(yè)/共26頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握豬丹毒桿菌檢驗(yàn)的基本原理和方法；2、了解檢驗(yàn)豬丹毒桿菌的意義。第2頁(yè)/共26頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

豬丹毒(Swineerysipelas)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種人畜共患傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。豬丹毒桿菌分為兩個(gè)種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌，其中僅紅斑丹毒絲菌是具有致病力的毒力種，對(duì)豬最易感并有很強(qiáng)的致病性，至今已發(fā)現(xiàn)la,1b,2-24和N型共26個(gè)血清型，大約80%以上的豬源性分離株屬1型(la和1b)和2型，我國(guó)優(yōu)勢(shì)血清型也為1a,1b和2型。

第3頁(yè)/共26頁(yè)“大紅袍”類丹毒不規(guī)則鮮紅色斑塊第4頁(yè)/共26頁(yè)大紫腎：典型的敗血脾;腎淤血、腫大心瓣膜增生：疵狀心內(nèi)膜炎的病變，二尖瓣和主動(dòng)脈瓣出現(xiàn)菜花樣增生物脾充血腫大第5頁(yè)/共26頁(yè)三、檢驗(yàn)程序第6頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟（一）增菌

以無(wú)菌操作取檢樣，用乳缽加滅菌砂磨碎，無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~10h。（二）分離和培養(yǎng)

對(duì)沒(méi)有受污染的新鮮病料可直接接種在血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h?；蚪?jīng)TSB肉湯37℃培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。第7頁(yè)/共26頁(yè)

血清瓊脂：菌落特征：細(xì)小、圓形、透明、凸起、灰白色、有光澤、質(zhì)軟、露珠樣、易混懸于鹽水中。第8頁(yè)/共26頁(yè)血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄溶血環(huán)（α溶血）第9頁(yè)/共26頁(yè)TSB肉湯：輕度混濁，振動(dòng)試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌環(huán)。第10頁(yè)/共26頁(yè)革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體細(xì)長(zhǎng)、長(zhǎng)短不一，有時(shí)呈長(zhǎng)絲形，單獨(dú)存在，有時(shí)呈短鏈或V形排列。第11頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)自TSA瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺。以無(wú)菌操作將各菌分別穿刺接種至SIM培養(yǎng)基中，將所有試管置于37℃下培養(yǎng)24-48小時(shí)。第12頁(yè)/共26頁(yè)如試管5：本試驗(yàn)可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。第13頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時(shí)，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時(shí)為陽(yáng)性。V-P試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)檢驗(yàn)。第14頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟（三）生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果葡萄糖﹢枸鹽酸鹽-乳糖﹢靛基質(zhì)-果糖﹢硫化氫﹢蔗糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-鼠李糖-木糖-M.R.(甲基紅)-V-P-氧化酶-過(guò)氧化氫酶-硝酸鹽還原-明膠不液化注：＋表示陽(yáng)性;－表示陰性。第15頁(yè)/共26頁(yè)（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟1、引物：P1：5'-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3'P2：5‘-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3'第16頁(yè)/共26頁(yè)豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟2、反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25μL，其中含有12.5μL的PCRMasterMix，10μmol/L上、下游引物各1μL,1μg/LDNA模板5μL，滅菌雙蒸水6.5μL。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

第17頁(yè)/共26頁(yè)豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟3、反應(yīng)條件：

95℃，5min95℃，1min63℃，1min40次循環(huán)

72℃，1min72℃，10min（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

第18頁(yè)/共26頁(yè)（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟4、DNA的提?。簩⒈粰z菌株接種于3mLTSB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(150r/min)10~12h后，取1mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，經(jīng)12000r/min4℃離心5min，棄去上清液，用200μLddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10min，隨后立即在冰中冷卻，然后在12000r/min及4℃條件下離心5min，取上清液為豬丹毒桿菌基因組DNA模板。第19頁(yè)/共26頁(yè)豬丹毒桿菌的檢測(cè)步驟5、電泳檢測(cè)：取5μLPCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

第20頁(yè)/共26頁(yè)937bpM123420001000750500250100豬丹毒桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖說(shuō)明：M—DL2000；1—陽(yáng)性對(duì)照；2、3——被檢樣品；4—陰性對(duì)照。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

第21頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性昆明小鼠，體重18~22g器材：1ml注射器，鼠籠，墊料（所有器皿均經(jīng)高壓消毒）。第22頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2.實(shí)驗(yàn)步驟每組取2只小鼠，以每只0.2mL劑量進(jìn)行一次性腹腔注射1只，另一只注射0.2mL無(wú)菌生理鹽水，觀察，分別記錄小鼠死亡狀況。第23頁(yè)/共26頁(yè)四、操作步驟四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3.病理解剖和細(xì)菌分離病理解剖