病毒的遺傳分析第1頁/共48頁第一節(jié)、病毒概述一、病毒的一般特性與類型1、病毒的一般特性病毒無細胞結構，不屬于原核生物，單獨一類.病毒沒有合成蛋白質(zhì)外殼所必須的核糖體,所以必須感染活細胞，利用宿主的代謝合成機器、能量和合成核酸與蛋白質(zhì)的底物，才能合成新的病毒后代。病毒=蛋白質(zhì)外殼(衣殼)+核酸(DNA或RNA)第2頁/共48頁煙草花葉病毒腺病毒T4噬菌體艾滋病病毒

RNA

DNA

DAN

RNA第3頁/共48頁2、病毒的類型病毒按宿主噬菌體植物病毒動物病毒按核酸ss-RNA型ds-RNAss-DNAds-DNA按侵染周期溫和型的烈性的按存在狀態(tài)原病毒（噬菌體）侵染型病毒（噬菌體）第4頁/共48頁病毒類別核酸類型核酸形狀核酸長度類病毒1-RNAO＜0.2kb1.噬菌體：T2、T42-DNAL162.0kbT52-DNAL117.0kb

2-DNAL/O51.9kbP222-DNAL40.5kbT72-DNAL37.5kb

62-RNAL(M)14.1kb

X1741-DNAO5.4kbR17、F2、MS21-RNAL3.0kbL:線狀、O:環(huán)狀、M:基因組含幾個片斷、1=單鏈、2=雙鏈第5頁/共48頁病毒(virus)類別核酸類型形狀核酸長度2.植物病毒:創(chuàng)傷腫瘤病毒（WTV）2-RNAL21.0kb

雀麥花葉病毒（BMV）1-RNAL(M)9.0kb

馬鈴薯X病毒（PVX）1-RNAL8.67kb

花椰菜花葉病毒（CaMV）2-DNAO8.1kb

煙草花葉病毒（TMV）1-RNAL6.3kb

蕪菁黃色花葉病毒(TYMV)1-RNAL6.0kb3.動物病毒:鳥痘病毒2-DNAL?300.0kb

牛痘苗病毒2-DNAL240.0kb

皰疹病毒2-DNAL15.9kb

呼腸孤病毒(reovirus)2-RNAL3.4kb

口蹄疫病毒（FMDV）1-RNAL10.3kb

脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio)1-RNAL(M)7.8kb

多瘤病毒(polyoma)2-DNAO4.5kbL:線狀、O:環(huán)狀、M:基因組含幾個片斷、1=單鏈、2=雙鏈核酸分子長度與堿基數(shù)的關系：3kb=1?第6頁/共48頁

在遺傳學研究中使用最為廣泛的是噬菌體三大特點：繁殖周期短、易得大群體、基因組小。第7頁/共48頁第8頁/共48頁2009年3月起源于墨西哥和美國的甲型H1N1

流感，為A型流感病毒，屬于H1N1亞型流感病毒毒株。H1N1為單股RNA病毒，基因組13.6kb，含8個獨立的基因片段，分別編碼RNA聚合酶PB1，聚合酶PA，PB1-F2和PB2，基質(zhì)蛋白M1和M2，非結構蛋白NS1和2，核衣殼蛋白NP，凝血酶素HA和神經(jīng)氨酸NA。第9頁/共48頁PB2和PA來自于禽的H5N1PB1來自人的H3N2HA,NP和NS來自北美豬的H1N1；NA和MP來自歐洲豬的H1N1第10頁/共48頁SARS病毒——一種全新的冠狀病毒

冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是一個單一的RNA分子。這種RNA和N蛋白共同組成病毒，有三個結構蛋白，屬糖蛋白。冠狀病毒的特點是RNA和RNA之間重組率非常高，出現(xiàn)變異正是由于這種很高的重組率。第11頁/共48頁第12頁/共48頁禽流感病毒第13頁/共48頁二、噬菌體的繁殖1、第14頁/共48頁2、溫和噬菌體的侵染周期

溫和性噬菌體中λ和P1噬菌體各代表了一種略有不同的溶源性類型溫和性噬菌體的生活周期有兩個：一個是溶源性周期，即在噬菌體侵入后并不裂解細菌，而是將其DNA分子整合到細菌基因組DNA上，這樣的噬菌體叫原噬菌體。帶有原噬菌體的細菌叫溶源性細菌。溶源性細菌有兩個特點：一是免疫性，二是可誘導另一個是裂解周期，即在有關因素誘導下，原噬菌體基因依次表達，產(chǎn)生大量子代噬菌體，并裂解細菌細胞后釋放出來。第15頁/共48頁λ噬菌體的生活周期

整合到宿主基因組中的原噬菌體僅少數(shù)基因活動，表達出阻遏物關閉自身其它基因第16頁/共48頁P1噬菌體的生活周期第17頁/共48頁T7噬菌體T7噬菌體的生活周期第18頁/共48頁三、噬菌體的突變型1、條件致死突變型能夠得到的噬菌體突變型有形態(tài)突變型（噬菌斑大小、邊緣清晰度、透明程度的變化）、寄主范圍突變型和條件突變型。條件致死突變型：在某些條件下是致死的。使條件致死突變型噬菌體不能存活或繁殖的條件叫限制條件；條件致死突變型噬菌體能夠存活或繁殖的條件叫許可條件。第19頁/共48頁常見的條件致死突變型有兩種：①溫度敏感突變：熱敏突變→限制條件≥40℃

冷敏突變→較低溫度下致死②抑制因子敏感型突變sus:噬菌體發(fā)生了無義突變許可條件→宿主菌帶有抑制因子（su+）限制條件→宿主菌沒有抑制因子（su-）第20頁/共48頁2、噬菌斑形態(tài)和宿主范圍的突變型①噬菌斑形態(tài)突變型②宿主范圍的突變型宿主范圍的突變型其本質(zhì)也是條件致死突變型之一。

T4噬菌體rⅡ突變侵染大腸桿菌B能產(chǎn)生大的噬菌斑，侵染大腸桿菌K是致死的，侵染S產(chǎn)生小的噬菌斑。第21頁/共48頁

抑制因子敏感型突變sus實質(zhì)就是無義突變，即編碼氨基酸的正常密碼子突變成了終止密碼:→UAA:赭石突變、→UAG:琥珀突變、→UGA:乳白突變。宿主菌的無義抑制基因su+也是一種突變基因，即攜帶某個氨基酸的tRNA的反密碼子突變成了與一個終止密碼互補的特殊反密碼子，與噬菌體的無義突變能互補配對，合成正常長度的蛋白質(zhì)。2、無義突變與無義抑制基因第22頁/共48頁在不同專一抑制基因宿主菌中sus突變噬菌體的表現(xiàn)噬菌體基因型宿主菌基因型su－su+

琥珀型su+

赭石型su+

乳白型野生型++++sus琥珀型－++－sus赭石型－－+－sus乳白型－－－+第23頁/共48頁

無義抑制當然也會使其它基因編碼的蛋白質(zhì)變得更長，但正常（野生型）蛋白質(zhì)仍占多數(shù)。5種琥珀抑制基因的性質(zhì)琥珀型su+插入的氨基酸蛋白質(zhì)占野生型%su1+絲氨酸28su2+谷氨酰胺14su3+酪氨酸55su4+酪氨酸16su5+賴氨酸5第24頁/共48頁第二節(jié)：噬菌體染色體作圖一、噬菌體突變型的兩點測驗2、由于h–和h+均能感染品系1，用T2的兩個親本h–r+和h+r–同時雙重感染品系1,即可得到重組型噬菌體。1噬菌體性狀形態(tài)宿主范圍正常r+突變r-大、邊緣清楚小、邊緣模糊感染E.coli的菌株不同正常h+

→品系1突變h-

→品系1和2第25頁/共48頁h-r+

×

h+r-↓品系1h-r+h+r-h-r-h+r+親型

h-r+

→透明、小重組型

h-r-

→透明、大噬菌斑

h+r-

→半透明、大噬菌斑

h+r+

→半透明、小

重組值=────────×100%(h+r+)+(h-r-)4

種噬菌斑總數(shù)第26頁/共48頁不同速溶菌的突變型在表現(xiàn)型上不同，可分別寫成ra-、rb-、rc-等，用rx–h+×rx+h-獲得試驗結果列于下表：雜交組合各基因型（%）重組值

r-h+

r+h-

r+h+

r-h-Ra-h+×ra+h-34.0

42.012.0

12.024.0/100=24%Rb-h+×rb+h-32.0

56.05.9

6.412.3/100.3=12.3%Rc-h+×rc+h-39.0

59.00.70.9

1.6/99.6=1.6%分別作出ra、rb、rc與h的三個連鎖圖:第27頁/共48頁四種可能的基因排列連鎖圖:再做雜交：rc-rb+

×

rc+rb-↓結果表明:rc–rb的重組值>rb–h∴h位于rb及rc之間，排列順序→rc–h–rb。由于T2噬菌體的連鎖圖是環(huán)狀的，所以2、3排列都對。第28頁/共48頁二、噬菌體突變型的三點測驗Kaiser(1955)最先進行l(wèi)噬菌體的重組作圖。紫外線照射處理獲5個l噬菌體突變系,產(chǎn)生不同噬菌斑：

co1系:中央環(huán)之外部分表現(xiàn)清亮；co2系:更濃密的中央環(huán)第29頁/共48頁s系:小噬菌斑;mi系:微小噬菌斑;c系:完全清亮;凱澤利用l噬菌體的三突變與野生型進行雜交作圖S

co1mi

×

+

+

+第30頁/共48頁λ噬菌體的基因組遺傳圖第31頁/共48頁2、噬菌體突變基因的重組特點1)、兩個親代對子代的遺傳貢獻很難完全相同兩個親代對子代的遺傳貢獻，取決于進行雙重感染時兩個親代噬菌體各自的用量噬菌體的用量=裂解液的滴度×體積分離群體：親本型Ⅰ的量≠親本型Ⅱ的量2)、不能區(qū)分子代噬菌體是第一代還是第幾代噬菌體在DNA復制以后即進行基因重組。一個受到雙重感染的宿主菌細胞內(nèi)，噬菌體不斷地重復著“復制重組”循環(huán)，直到噬菌體DNA第32頁/共48頁被外殼蛋白包裝起來為止。一個裂解前的宿主菌單細胞內(nèi)，就形成了包含所有可能基因型的噬菌體“交配庫”（matingpool）。3)、不同基因型噬菌體之間常常發(fā)生多次交換4)、提前進行人工裂解可降低基因重組頻率用1.0mMKCl處理可使E.coli細胞裂解第33頁/共48頁第三節(jié)：噬菌體基因組與原噬菌體一、噬菌體基因組的一般結構：

48,502bp，線狀ds-DNA，兩端具有12nt的5`-單鏈末端(5`-GGGCGGCGACCT-3`)，稱為cos末端，可被編碼的末端酶所識別，該酶是一個二聚體，由兩個基因Nul和A編碼的蛋白質(zhì)組成。第34頁/共48頁噬菌體的線狀ds-DNA進入宿主菌細胞后,兩端的cos末端互補配對,斷口由DNA連接酶接上,形成環(huán)狀的ds-DNA。這時12bp的cos末端序列互補區(qū)叫cos位點。此后，轉錄早期表達蛋白，有兩個發(fā)展方向：1、溶源性反應；2、大量復制→裂解宿主菌第35頁/共48頁二、噬菌體的生活周期1、DNA的復制與生活周期圖示利用兩端的cos末端序列進行環(huán)化并由連接酶封口利用滾環(huán)復制方式進行大量復制逐個在COS位點切開后包裝第36頁/共48頁2、噬菌體生活周期與基因的有序表達

1、最早期轉錄→產(chǎn)生Ｎ蛋白和cro蛋白，間或止于tR2→產(chǎn)生Ｏ、Ｐ蛋白

2、后早期轉錄→N蛋白E.coli轉錄終止因子ρ失活→轉錄通過tR1、tR2和tL進入其余早期基因區(qū)域

3、DNA復制→產(chǎn)生了DNA復制蛋白Ｏ和Ｐ后，雙向復制開始，進而進行滾環(huán)復制。red

cro

cIIOpOri噬菌體顆粒的形成

頭部尾部b2區(qū)與存活無關

免疫調(diào)控溶源/裂解復制晚期控制裂解AWBCDENu3F1F2ZUVGTHMLKIJ

intxisexo

CIIINcIQSR全長48502

bp

整合、切除與重組NulattAtt為噬菌體附著區(qū)第37頁/共48頁

4、后期轉錄→cro蛋白與OL和OR結合，阻止RNA聚合酶與PL和PR結合，轉錄終止。此時控制蛋白Ｑ對P`R起激活作用，導致后期基因轉錄

5、裂解→后期基因轉錄產(chǎn)生大量Ｒ和Ｓ編碼產(chǎn)物，細菌細胞裂解，噬菌體顆粒釋放第38頁/共48頁三、噬菌體的溶源性反應1、噬菌體的基因組通過att位點整合到細菌染色體E.coli的att位點叫attB，噬菌體的att位點叫attP。attB和attP有一個相同的15bp核心序列。通過缺失實驗證明，attP至少要約250bp長，太短將使其功能喪失。attP可繞在整合酶分子的周圍，類似核小體的結構。而attB則較短，約23bp長即有功能。attB的序列結構特征：核心序列Ｏ在中間，兩側的序列稱為臂，分別是B和B’，記為BOB`序列。Ｏ是attB和attP所共同的。第39頁/共48頁

attP的序列結構特征也是一樣，記為POP`序列。整合酶和IHF在att上都有特定的結合位點。每一次整合的重組過程需要20－40個整合酶分子和約70個IHF分子。說明這兩種蛋白不僅僅是酶（起催化作用），而且在形成某種復合物結構中起著重要作用。

第40頁/共48頁2、DNA的整合與切出噬菌體對裂解途徑和溶源途徑的選擇，取決于宿主菌與噬菌體基因產(chǎn)物間錯綜復雜的平衡。

cII+cIII→PE→cI和int基因表達

cI產(chǎn)物阻遏或中斷所有基因表達，int產(chǎn)物識別attB和attP，并執(zhí)行“切開—連接”的整合操作。第41頁/共48頁3、原噬菌體與合子誘導F因子原噬菌體帶有原噬菌體的E.coliHfr菌株染色體a+b－c+供體：Hfr+原對噬菌體敏感的E.coliF－菌株染色體a－b+c－受體：F-×a－b+c－a+b－c+a+b－c+a+a+b－c+a－b+c－b－c+a－b+c－a+b－c－c+a－a－b+c－a+b－c+第42頁/共48頁第五節(jié)：環(huán)狀排列與末端重復１、線性DNA具有環(huán)狀的遺傳圖T2、T4噬菌體的DNA：電泳檢測、放射自顯影→線性分子重組實驗→連鎖遺傳圖→環(huán)狀圖2、在線性與環(huán)狀間轉換，需要有末端重復序列。有嗎？用DNA外切酶III酶切檢驗(3`→5`逐個切下單核苷酸第43頁/共48頁5`GTAGATC——————CACTGAG3`3`CATCTAG——————GTGACTC5`如果沒有末端重復序列5`GTAGATC——————CAC3`CATCG3`TAG——————GTGACTC5`AGT5`GTAGATCGTGACTC3`

保溫5`GTAGTTC——