試驗(yàn)方法與步驟：、葉綠素含量的測(cè)定：將葉片（所有處理都取同一部位）剪碎混勻，每處理稱取約0.2g葉片（3次重復(fù)）放于研缽，加入少量石英砂及碳酸鈣及3ml左右80%的丙酮，研成勻漿，再加10ml80%的丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白靜置3分鐘左右，過(guò)濾入25ml試管（事先用報(bào)紙包裹遮光），用80%的丙酮多次沖洗研缽、研棒、殘?jiān)盀V紙，直至無(wú)綠色。80%的丙酮定容。80%的丙酮然為空白，取樣液于比色杯中在波長(zhǎng)663nm、646nm、470nm下測(cè)定吸光度。以Lichtenthaler法計(jì)算葉綠素含量及類胡蘿卜素含量。Ca=12.21A663-2.81A646Cb=20.13A646-5.03A663C=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229= mg/L求得色素的濃度后，再按下式計(jì)算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量：葉綠體色素的含量=（色素的濃度X提取液體積X稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重或干重=mg/g二、酶的粗提取液A：0.2MNaH2PO4 31.21gNaH2PO4.2H20定容至1000mlB：0.2MNa2HPO4 71.64gNa2HPO4.12H20定容至1000ml0.05mol/L的磷酸緩沖液（PH=7.8）：21.25mlA力口228.75mlB,用水定容至1000ml選取長(zhǎng)勢(shì)相同的植株，每組處理取葉片0.5g，3次重復(fù)，放入預(yù)冷的研缽中，先加入1ml0.05mol/L的磷酸緩沖液（PH=7.8）及少量石英砂（為了離心時(shí)平衡最好提前稱取0.2g石英砂20份），冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，再用4ml上述緩沖液多次沖洗研缽及缽棒，合并入離心管，總體積為5ml，搖勻后冷藏靜置4小時(shí)以上，3000r/min離心15min（0?4°C），上清液即為酶的粗提取液,4C保存。（1）?可溶性蛋白含量測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的配制：.1g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml并用蒸餾水定容至1000ml；過(guò)濾于棕色瓶中保存（最多保存一個(gè)月）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣：準(zhǔn)確配制1mg/mL白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣，按下表在各管中加樣，配制成一系列不同濃度的白蛋白溶液。管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)白蛋白（mL）00.020.040.060.080.1磷酸緩沖液或蒸餾水（mL）0.1(100uL)0.080.060.040.020考馬斯亮蘭G250（mL）333333蛋白含量（mg）00.020.040.060.080.1將溶液搖勻后，靜置2min。在595nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，以0D值為橫坐標(biāo)，白蛋白量（mg）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？扇苄缘鞍椎臏y(cè)定：lOOul酶液+3mlG250，充分混合均勻后準(zhǔn)確放置2min，在595nm波長(zhǎng)下比色并記錄。同時(shí)做空白（lOOul磷酸緩沖液+3mlG250）。比色皿和試管用酒精沖洗（每次都要用少量酒精清洗，再用蒸餾水洗）。結(jié)果計(jì)算：樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）=（CXV/a）/wC：查標(biāo)準(zhǔn)曲線（參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線）所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）；V：提取液總體積（mL）a：測(cè)定所取提取液體積（mL）w：取樣量（g）（2）?過(guò)氧化物酶（POD），采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。POD反應(yīng)液的配制：0.05mol/LPH7.8的磷酸緩沖液100mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚56uL，用磁力攪拌器加熱攪拌使之完全溶解，待溶液冷卻至室溫后加入30%H2O28uL混合均勻，冷藏保存于冰箱中（0?4°C,且要密封保存）。POD的測(cè)定：20uL酶上清液+3mLPOD反應(yīng)液加入比色皿中，以不加酶液而加相同體積的磷酸緩沖液為空白對(duì)照。在470nm波長(zhǎng)下每隔1min比色讀數(shù)一次共3次；以每min每mg蛋白吸光度變化0.01（△A470/min.g.FW）表示酶活性的大小。結(jié)果計(jì)算：POD酶活性=100X（AA470XV）/（aXWXt）V：樣液總體積（mL） a：測(cè)定時(shí)樣品體積（mL）W：樣品重（g） t：反應(yīng)時(shí)間（min）（3） ?過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定，采用紫外吸收光測(cè)定。（CAT反應(yīng)液）0.1mol/L的H2O2:5.68mL市售30%H2O2稀釋至1000mL反應(yīng)液的配制：0.1mol/L的H2O215mL+0.05mol/LPH7.8的磷酸緩沖液60mL,混合均勻。CAT的測(cè)定：0.1mL酶液（先加，直接加到比色皿）+2.5mLCAT反應(yīng)液，于240nm波長(zhǎng)下比色，以0.1mL磷酸緩沖液+2.5mLCAT反應(yīng)液作空白對(duì)照。每隔1min讀數(shù)1次（共3次）；以每min每mg蛋白吸光度變化值0.01表示酶活性。結(jié)果計(jì)算：CAT酶活性（△A240min.g.FW）=（△A240XV）X100/（aXWXt）V：樣液總體積（mL） a：測(cè)定時(shí)樣品體積（mL）W：樣品重（g） t：反應(yīng)時(shí)間（min）（4） ?SOD0.05mol/L磷酸緩沖液（PH7.8）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100mL750umol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100mL，遮光保存100umol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000mL20umol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000mL，遮光保存反應(yīng)液：磷酸緩沖液與后四種溶液以5：3:3:3:3的比例混合測(cè)定：取0.1mL上述酶提取液（4支對(duì)照加0.1mL磷酸緩沖液），弱光下迅速加入2.9mL反應(yīng)液，2支對(duì)照置于暗處用于調(diào)零，其余各管均置4000lx下反應(yīng)30min,蓋黑布終止反應(yīng),，用紫外分光光度計(jì)在560nm下測(cè)定其吸光度。(注意要求各管透明度好并且統(tǒng)一規(guī)格)SOD酶活性=(A0-A)XVT/(AX0.5XWXV)0s T0 1式中：A0：對(duì)照管吸光度；As：樣品管吸光度；VT：樣液總體積(mL)V:測(cè)定時(shí)樣品體積(mL)； W：樣品重(g)1(5)?MDA(丙二醛)含量測(cè)定0.67%硫代巴比妥酸(TBA)取上述酶提取液2mL,加0.67%的TBA溶液4mL,封口沸水浴15min,迅速冷卻后再離心,取上清液。在660nm、532nm、450nm下測(cè)定其吸光度,通過(guò)以下公式求得濃度。C(umol.L-1)=6.45X(A-A)-0.56XA532 600 450MDA(umol.g-1)=CXV/W式中：V：樣液總體積(mL)；C：MDA濃度(umol.L-1)；W：樣品重(g)三、可溶性糖含量蔥酮乙酸乙酯試劑：取分析純蔥酮1g,溶于50mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中,在黑暗中可保存數(shù)周,如有結(jié)晶析出,可微熱溶解。1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：將分析純蔗糖在80°C下烘至恒重，精確稱取l.OOOg。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)糖(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)2.01.81.61.41.21.0糖量(ug)020406080100100ug/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。稱取0.3g樣品鮮葉，加10mL蒸餾水，封口沸水浴1h(30min1次，共提取2次），用濾紙漏斗過(guò)濾，反復(fù)沖洗殘?jiān)ㄈ葜?5mL刻度試管中。吸取提取液ImL,加蒸餾水ImL（對(duì)照加2mL）,蔥酮乙酸乙酯0.5mL,再加入濃硫酸5mL,充分振蕩，沸水浴準(zhǔn)確計(jì)時(shí)lmin,自然冷卻至室溫，于630nm下比色。同時(shí)用分析純蔗糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照以下公式計(jì)算可溶性糖的含量?？扇苄蕴呛?（CXV/aXn）/（WX106）式中：C：標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量（ug）a：吸取樣液體積（mL）V：提取液量（mL）n：稀釋倍數(shù)W：材料重量（g）四、脯氨酸2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6Mol/L磷酸以3:2混合，作為溶劑進(jìn)行配制,此液在4°C下2?3d有效；冰醋酸、甲苯、磷酸3%的磺基水楊酸：3g磺基水楊酸溶于100mL水中。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250mL,其濃度為lOOug/mL。再取此液lOmL，用蒸餾水稀釋至lOOmL，即成lOug/mL的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)管號(hào)O12345lOug/mL的Pro標(biāo)準(zhǔn)液(mL)OO.2O.4O.6O.81.O蒸餾水（mL）2.O1.81.61.41.21.OPro(ug)O24681O稱取O.3g葉片鮮樣，加入3%的磺基水楊酸5mL,加蓋沸水中提取lOmin,冷卻至室溫后過(guò)濾，吸取濾液2mL（及標(biāo)準(zhǔn)樣