南瓜熱激蛋白相關(guān)基因CmHSP70-5的克隆和高溫脅迫下的表達(dá)分析胡艷平;周揚(yáng);楊春;廖道龍;朱白婢;王敏;黃文楓;張文;云天?！酒诳Q】《《中國(guó)蔬菜》》【年（卷），期】2019（000）008【總頁(yè)數(shù)】6頁(yè)（P28-33）【關(guān)鍵詞】南瓜;高溫脅迫;CmHSP70-5基因;基因表達(dá)【作者】胡艷平;周揚(yáng);楊春;廖道龍;朱白婢;王敏;黃文楓;張文;云天?！咀髡邌挝弧亢Ｄ鲜∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所海南省蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南省瓜菜育種工程技術(shù)研究中心海南?？?71100;海南大學(xué)園藝學(xué)院海南?？?70228;海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南?？?71100【正文語(yǔ)種】中文海南省具有得天獨(dú)厚的生態(tài)優(yōu)勢(shì)和氣候條件，蔬菜栽培由來(lái)已久，是我國(guó)最主要的南菜北運(yùn)基地。隨著人民生活和消費(fèi)水平的不斷提高，迫切要求各種蔬菜作物實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)和供應(yīng)。但蔬菜作物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中常常會(huì)受到各種非生物脅迫的影響，其中高溫脅迫是影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因子之一。蔬菜作物對(duì)于高溫脅迫的響應(yīng)并非完全是被動(dòng)的，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制來(lái)降低脅迫造成的危害（韓笑冰等，1997；葉陳亮等，1997），以維持基本的代謝過程，甚至通過開啟某些基因或者酶的表達(dá)來(lái)緩解高溫帶來(lái)的危害（秦俊等，2001；田靖和郭世榮，2012;閆圓圓等，2016）。因此，通過研究蔬菜作物的耐熱機(jī)理，可以有助于人們培育出耐高溫的蔬菜新品種。植物在進(jìn)化過程中形成了許多應(yīng)對(duì)高溫逆境的機(jī)制，包括基礎(chǔ)耐熱性和獲得耐熱性。當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，一些基因被激活，從而導(dǎo)致一些代謝物和蛋白的含量增加，這些基因中有些可能會(huì)保護(hù)植物免受高溫脅迫的傷害，有些可能會(huì)激活某些特定基因的表達(dá)從而增強(qiáng)植物的耐熱性。目前已經(jīng)克隆的與植物耐熱性有關(guān)的基因主要分為熱激蛋白（HSPs，heatshockproteins）、熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs，heatstresstranscriptionfactors）、與膜穩(wěn)定性、抗氧化和激素相關(guān)的基因等。熱激蛋白（HSPs）被認(rèn)為是熱脅迫誘導(dǎo)的一類蛋白，其中包括：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和smallHSP（sHSP）（方麗平和李進(jìn)步，2007）。Katiyar-Agarwal等（2003）將擬南芥的hsp101基因?qū)胨?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性有一定程度的提高且產(chǎn)量穩(wěn)定。將玉米ZmHSP22基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系生育期縮短，同時(shí)耐熱性增強(qiáng)（Rhoadsetal.，2005）。在擬南芥中過量表達(dá)菊花HSP70基因可以增強(qiáng)植株對(duì)高溫脅迫的耐受性（Songetal.，2014）。將番茄熱激蛋白基因Lehsp100反義敲除后，轉(zhuǎn)反義鏈的株系和對(duì)照相比耐熱性下降（Yangetal.，2006）。對(duì)海帶Sjhsp70基因在溫度脅迫下的表達(dá)變化分析表明，高溫對(duì)Sjhsp70的表達(dá)量具有顯著影響（袁艷敏等，2018）。南瓜起源于中、南美洲，包括30個(gè)種，其中有5個(gè)栽培種：中國(guó)南瓜（Cucurbitamoschata）、美洲南瓜（C.pepo）、印度南瓜（C.maxima）、灰籽南瓜（C.mixta）以及黑籽南瓜（C.ficifolia）。不同南瓜品種的耐熱性差異較大，不耐熱品種在高溫季節(jié)及溫室栽培下容易受到高溫傷害。一般認(rèn)為，中國(guó)南瓜廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，生長(zhǎng)發(fā)育的適宜溫度一般為18~32°C，具有較好的高溫適應(yīng)性，但溫度超過35C時(shí)，雄花易變?yōu)閮尚曰?。海南地處熱帶邊緣，夏季太?yáng)輻射強(qiáng)，平均氣溫在25C以上，極端最高氣溫超過38C,高溫嚴(yán)重制約著海南南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開展南瓜對(duì)高溫脅迫的機(jī)理研究，對(duì)于篩選培育出耐熱的南瓜品種，豐富海南南瓜品種資源具有深遠(yuǎn)意義。本試驗(yàn)基于南瓜基因組的數(shù)據(jù)，從南瓜中分離1個(gè)熱激蛋白相關(guān)基因CmHSP70-5，對(duì)其在高溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析研究，以期為深入探討南瓜耐熱機(jī)理提供理論指導(dǎo)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料及處理于2018年11月選用海南地區(qū)廣泛種植的蜜本南瓜（Cucurbitamoschata）,將種子播種在裝滿基質(zhì)（泥炭土：蛭石=1V：1V）的花盆中，放置在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出3片真葉后，進(jìn)行37°C和42°C持續(xù)高溫處理，分別在高溫處理后0、3、6、12、24、48h取南瓜幼苗的根、莖、葉，用超純水清洗，然后用液氮速凍后立即放入-80°C保存以備提取RNA。整個(gè)試驗(yàn)均在海南省瓜菜育種工程技術(shù)研究中心完成。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒（RNAprepPurePlantKit,目錄號(hào)：DP441）提取南瓜幼苗的RNA，采用寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔PrimeScriptRTreagentkitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）,目錄號(hào)：DRR047A〕進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參照說(shuō)明書。1.3基因克隆從南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（/genome/?term=Cucurbita+moschata）中獲得CmHSP70-5基因的序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為HSP70-5-F:5'-ATGGCAGCGAAAACTGAAG-3',HSP70-5-R:5'-TCAATCAACCTCCTCGATCTTC-3'。以南瓜cDNA為模板，采用Vazyme公司的2xTaqMasterMix（目錄號(hào)：P112）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pEASY-Tl（北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)：CT101-01）載體上，挑取陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)南瓜CmHSP70-5基因的熒光定量引物，內(nèi)標(biāo)基因選用文獻(xiàn)報(bào)道中的Actin基因（王安君等，2016）。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列為：CmHSP70-qRT-F:5'-CGTTGCTTATGGTGCTGCTGT3,CmHSP70-qRT-R:5'-CTGTTCTTTCTTTGTTGGGATTGTT3;CmActin-F:5f-CGGCCATTGAGAAAAGCTACGAACT-3',CmActin-R:5'-CCCACCACTGAGGACGATGTTACCA-3'。用未經(jīng)高溫處理的根、莖、葉反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，研究CmHSP70-5基因在不同組織中的表達(dá)差異；以高溫處理后不同時(shí)間的根、莖、葉cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR,研究CmHSP70-5基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式。熒光定量PCR采用TaKaRa公司SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）試劑盒（目錄號(hào)：DRR820A）,在ABI7900HTFastReal-TimePCRSystem儀器上運(yùn)行，Real-TimePCR反應(yīng)體系參照說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性30s;94°C變性5s,60C退火延伸30s,45個(gè)循環(huán)；結(jié)束后讀取熒光信號(hào)：95C15s,60C15s,95C15s,進(jìn)行熔解曲線分析。采用比較CT法來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△&,其中wCtw]Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因）對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行作圖分析。2結(jié)果與分析2.1南瓜幼苗RNA提取及反轉(zhuǎn)錄將南瓜幼苗經(jīng)過37C和42°C高溫處理，分別在0、3、6、12、24、48h取其根、莖和葉片，用RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量較好，28S和18S較完整，且量較大（圖1）。按照說(shuō)明書的操作方法取適量的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用南瓜內(nèi)標(biāo)基因Actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，從圖2中可以看出，內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，無(wú)雜帶，且亮度基本一致，說(shuō)明cDNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。圖142°C高溫處理下根中的RNA1~6分別為高溫處理0、3、6、12、24、48h的南瓜幼苗。圖242C處理下根中的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2000marker;1~6:高溫處理后0、3、6、12、24、48h南瓜根中cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物；7:以ddH2O為模板的陰性對(duì)照。CmHSP70-5基因克隆從南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得CmHSP70-5基因（XM_023065965）的序列，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA混合作為模板，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增CmHSP70-5基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為2000bp的片段（圖3）,將PCR產(chǎn)物連接到T載體后，篩選陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序，確定CmHSP70-5基因全長(zhǎng)1953bp，測(cè)序結(jié)果與南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查到的序列完全符合，說(shuō)明目的基因擴(kuò)增正確。圖3CmHSP70-5基因的克隆M:DL2000marker;1,2:CmHSP70-5基因的PCR產(chǎn)物。利用MEGA7.0軟件將CmHSP70-5基因編碼的氨基酸序列與擬南芥HSP70蛋白家族成員進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)CmHSP70-5蛋白與擬南芥AtHSP70-5的親緣關(guān)系更近（圖4）。CmHSP70-5基因在不同組織中的表達(dá)分析提取未經(jīng)高溫處理的南瓜幼苗根、莖和葉中的總RNA，采用熒光定量PCR的方法研究這3個(gè)組織中CmHSP70-5基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CmHSP70-5基因在根中表達(dá)量最高，葉片中的表達(dá)量次之，約為根中表達(dá)量的42%；莖中表達(dá)量最少，約為根中表達(dá)量的11%（圖5）。圖4CmHSP70-5與擬南芥HSP70家族蛋白的進(jìn)化分析圖5CmHSP70-5基因在南瓜幼苗不同組織中的表達(dá)2.4不同溫度脅迫下CmHSP70-5基因在不同組織中的表達(dá)分析2.4.1不同溫度脅迫下根中CmHSP70-5基因的表達(dá)模式分析根中CmHSP70-5基因在高溫脅迫下上調(diào)表達(dá)，處理后3h表達(dá)量達(dá)到最高，37°C處理3h后的表達(dá)量約為起始表達(dá)量的10倍，42C處理3h后的表達(dá)量約為起始表達(dá)量的16倍，此后表達(dá)量降低，逐漸恢復(fù)到起始水平（圖6）。2.4.2不同溫度脅迫下莖中CmHSP70-5基因的表達(dá)模式分析雖然莖中CmHSP70-5基因的起始表達(dá)量較低（圖7）,但在高溫處理后，莖中CmHSP70-5基因受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，從圖7中可以看出，處理3h后基因的表達(dá)量達(dá)到最大，且在高溫處理后0~24h內(nèi)42C處理的CmHSP70-5基因表達(dá)量要高于37C同時(shí)期的基因表達(dá)量。圖6根中CmHSP70-5基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)圖7莖中CmHSP70-5基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)2.4.3不同溫度脅迫下葉中CmHSP70-5基因的表達(dá)模式分析與莖中基因表達(dá)量相似，葉片中CmHSP70-5基因在高溫處理3h后的表達(dá)量達(dá)最高，分別為起始表達(dá)量的1800倍（37C）和2860倍（42C）（圖8）,說(shuō)明葉片中CmHSP70-5基因的表達(dá)是一種高溫誘導(dǎo)模式。圖8葉中CmHSP70-5基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)3結(jié)論與討論植物生長(zhǎng)過程中，高溫是影響其生長(zhǎng)發(fā)育的一種重要非生物脅迫，而且溫室效應(yīng)導(dǎo)致全球氣溫升高，園藝植物生產(chǎn)面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)（范雙喜等，2003）。因此研究植物耐熱性，培育耐熱植物新品種已經(jīng)成為一項(xiàng)亟待解決的工作。植物的耐熱性是一個(gè)復(fù)雜的生理現(xiàn)象，是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀，包括熱激蛋白HSPs、熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFs、抗氧化和激素相關(guān)基因等。在高溫脅迫下，植物細(xì)胞中會(huì)表達(dá)和積累大量的HSPs，從而避免或減輕植物受到熱損傷，HSPs的積累量是由HSFs控制的，并在植物熱激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Wangetal.，2004）。在所有的HSPs中，HSP70家族蛋白是生物體內(nèi)分布最廣和研究最多的一類。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在植物生長(zhǎng)發(fā)育和各類植物脅迫響應(yīng)中至關(guān)重要（Sungetal.，2001；Swindelletal.，2007；Cho&Choi，2009；Zouetal.，2012；Kimetal.，2014）。擬南芥HSP70-1定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與植物的耐熱性相關(guān)（Sungetal.，2001；Cazaleetal.，2009）；缺失HSP70-15基因的擬南芥突變體植株矮小、耐熱性下降（Jungkunzetal.，2011）；高粱HSP70蛋白參與了其雄性不育系在不同溫度下的育性轉(zhuǎn)換（Chenetal.，1998）；葉用萵苣LsHsp70-2711屬于Hsp70基因家族，與葉用萵苣耐熱性相關(guān)（李雅博等，2017）；蠟梅HSP70-1基因在42°C高溫處理后1h表達(dá)量達(dá)到最高，說(shuō)明其參與了高溫脅迫響應(yīng)過程（阮文進(jìn)，2015）。本試驗(yàn)從南瓜中克隆到1個(gè)HSP70基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白與擬南芥AtHSP70-5蛋白的親緣關(guān)系較近，因此命名為CmHSP70-5。CmHSP70-5基因在南瓜幼苗的各部位均有表達(dá)，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CmHSP70-5基因的表達(dá)受到高溫脅迫誘導(dǎo)，在一段時(shí)間內(nèi)，溫度越高，表達(dá)量越高，這與其他植物中HSP70基因的表達(dá)模式相似（Sungetal.,2001；Jungkunzetal.,2011；陳二龍等，2018）。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)開展南瓜耐熱機(jī)制研究以及耐熱南瓜的選育有積極意義。參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】陳二龍，范志勇，王松峰，王德勛，朱凱，孫軍偉，蘇家恩，宋朝鵬.2018.煙草Hsp70基因家族的鑒定及NtHSP70chl基因的表達(dá)分析.中國(guó)煙草科學(xué)，39（2）：8-16.范雙喜，谷建田，韓瑩琰.2003.園藝植物高溫逆境生理研究進(jìn)展.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，18（2）：147-151.方麗平，李進(jìn)步.2007.植物熱激蛋白研究進(jìn)展.淮北煤炭師范學(xué)院學(xué)報(bào)，28（1）：43-47.韓笑冰，利容干，王建波.1997.熱脅迫下蘿卜不同耐熱性品種細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)比較.武漢植物學(xué)研究，15（2）：173-178.李雅博，李婷，韓瑩琰，范雙喜.2017.葉用萵苣熱激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高溫脅迫下的功能分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，50（8）：1486-1494.秦俊，傅徽楠，王玉勤.2001.芹菜的耐熱生理研究.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，（6）：24-27.阮文進(jìn).2015.蠟梅熱激蛋白70（HSP70）基因的克隆及功能分析〔博士論文〕.重慶：西南大學(xué).田婧，郭世榮.2012.黃瓜的高溫脅迫傷害及其耐熱性研究進(jìn)展.中國(guó)蔬菜，（18）：43-52.王安君，李玉丹，黃河勛，羅少波，吳廷全，李任強(qiáng)，鐘玉娟.2016.南瓜肌醇單磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆與表達(dá)分析.園藝學(xué)報(bào)，43（7）：1315-1325.閆圓圓，曾愛松，宋立曉，嚴(yán)繼勇.2016.結(jié)球甘藍(lán)幼苗耐熱性鑒定方法及耐熱生理.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，32（4）：885-890.葉陳亮，柯玉琴，陳偉.1997.大白菜耐熱性的生理研究III.酶性和非酶性活性氧清除能力與耐熱性.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，26（4）：498-501.袁艷敏，劉福利，梁洲瑞，汪文俊，孫修濤，王飛久.2018.海帶hsp70基因的克隆、分析及轉(zhuǎn)錄水平定量研究.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,39（4）：152-158.CazaleAC,ClementM,ChiarenzaS,RoncatoMA,PochonN,CreffA,MarinE,LeonhardtN,NoelLD.2009.Alteredexpressionofcytosolic/nuclearHSC70-1molecularchaperoneaffectsdevelopmentandabioticstresstoleranceinArabidopsisthaliana.JExpBot,60（9）：2653-2664.ChenJN,FuHY,QueQ,LuZX,SongLP,SunY.1998.EffectoftheexpressionofHSP70geneonthefertilityofsorghum.DevReprodBiol,7（2）：51-62.ChoEK,ChoiYJ.2009.Anuclear-localizedHSP70confersthermoprotectiveactivityanddrought-stresstoleranceonplants,BiotechnolLett,31（4）：597-606.JungkunzI,LinkK,VogelF,VollLM,SonnewaldS,SonnewaldU.2011.AtHsp70-15deficientArabidopsisplantsarecharacterizedbyreducedgrowth,aconstitutivecytosolicproteinresponseandenhancedresistancetoTuMV.PlantJ,66（6）：983-995.Katiyar-AgarwalS,AgarwalM,GroverA.2003.Heat-tolerantbasmatiriceengineeredbyover-expressionofhsp101.PlantMolBiol,51(5):677-686.KimBM，RheeJS，JeongCB，SeoJS，ParkGS，LeeYM,LeeJS.2014.Heavymetalsinduceoxidativestressandtriggeroxidativestress-mediatedheatshockprotein(hsp)modulationintheintertidalcopepodTigriopusjaponicus.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,166:65-74.RhoadsDM,WhiteSJ,ZhouY,MuralidharanM,ElthonTE.2005.Alteredgeneexpressioninplantswithconstitutiveexpressionofamitochondrialsmallheatshockproteinsuggeststheinvolvementofretrograderegulationintheheatstressresponse.PhysiolPlant,123(4):435-444.SongA,ZhuX,ChenF,GaoH,JiangJ,Ch