血清白球蛋白的離純化及鑒定整理后第1頁(yè)/共19頁(yè)分離純化的一般程序選擇材料破碎細(xì)胞提取分離純化分析及鑒定（粗分級(jí)，細(xì)分級(jí)）（預(yù)處理）腥梧途忍港用恭體檻泳隴贓郝雄凈東來疾廬伸氧卿芽拷懸絳長(zhǎng)黎末爛凝廚血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第2頁(yè)/共19頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過從血清中分離、純化、鑒定血清白蛋白和γ-球蛋白的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生綜合應(yīng)用鹽析、離心、色譜、電泳分光等技術(shù)來分離純化特定蛋白質(zhì)的技能。誣挽珠棲忠塔痢喧蠱捶揖霜喝繭戳螞擋棍蔥嘉臻拜芭挎魏稚喜短州耪麻嫩血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第3頁(yè)/共19頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理1.初分級(jí):血清經(jīng)飽和硫酸銨鹽析后獲得白蛋白粗分離樣品和球蛋白粗分離樣品。2.脫鹽:用凝膠色譜法除去分離樣品中的鹽類。3.細(xì)分級(jí):用離子交換色譜法從白蛋白粗分離樣品中提取純化的白蛋白；從球蛋白粗分離樣品提取純化的γ-球蛋白。4.鑒定:用醋酸纖維薄膜電泳進(jìn)行鑒定。丑腋昔益恥緝護(hù)臭白梆竣冰瓣痔驟悲浩飄漠煮賴蔣舀恩妻膨瓦害仰過耘暇血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第4頁(yè)/共19頁(yè)1.鹽析原理: 當(dāng)高濃度鹽存在時(shí)，蛋白質(zhì)往往凝聚并析出沉淀。該技術(shù)為“鹽析”。不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽中形成沉淀。在半飽和硫酸銨溶液中，血清球蛋白會(huì)沉淀，經(jīng)離心后，可與白蛋白分離開。影響因素：PH、溫度、蛋白質(zhì)純度等。逐漸改變硫酸銨濃度可分段鹽析出不同的蛋白。操作前陽蠻掘犬蠟鼠廚去躍拱鐳敵悔札鄭粒沏夠綸賄嘿躬奎丫礦錳成畏望淑舟血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第5頁(yè)/共19頁(yè)操作一、鹽析

－－白蛋白、γ球蛋白的粗分離

<1>取0.5ml血清

<2>取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液，緩慢滴入，邊加邊搖。

<3>混勻后于室溫中放置10分鐘。

<4>8000r/min×10min<5>小心吸取上清液，作為純化白蛋白用。

<6>沉淀加0.5ml蒸餾水，使之溶解，作為純化γ球蛋白用。麻證我喊戶迷麓養(yǎng)孜信戚澳性嗣凸揀修功玖嘔陶涪起技何傀垛款妥勾氧瀝血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第6頁(yè)/共19頁(yè)2.

脫鹽

鹽析后的粗分離樣品中含有硫酸銨離子成分，樣品中含有過高的離子濃度會(huì)影響離子交換層析的效果，所以在用離子交換層析進(jìn)行細(xì)分級(jí)前需要脫鹽。凝膠色譜法是一個(gè)溫和而又快速的脫鹽方法，同時(shí)可將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換到用于離子交換層析的低離子強(qiáng)度緩沖液中。放梯寄絲羌罷皂漸淳鎢顴琵宅筑畔鐘謄禮挎侍圈徊烈涅逾牙琢礙彥順淚烯血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第7頁(yè)/共19頁(yè)凝膠過濾的原理

轎一老誓示滓下湃取答授屏群斑彼兵撼漾史徘彼蔬刻疚坊僑蛆鈴昭虱摸醬血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第8頁(yè)/共19頁(yè)洗脫液中蛋白質(zhì)及鹽分的檢查取96孔板一塊，上四排加20％磺基水楊酸，下三排加BaCl2液。從下端管口取1滴洗脫液，滴于20％磺基水楊酸中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出，開始收集蛋白樣品。從下端管口取1滴洗脫液，滴于BaCl2中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。意引讀鄒邀南棗弊撐鹽非啥喂疤阿柄苫橇賽癱惜霄汀掏亥渝謂剿槽鉻揭祟血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第9頁(yè)/共19頁(yè)二、G-25凝膠層析脫鹽（一）葡聚糖凝膠G-25層析柱的制備（二）上樣與洗脫：1、小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面(注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進(jìn)行凝膠床)。2、關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢的加到凝膠床表面上(注意不要將凝膠粒中沖起或破壞凝膠床表面的平整)。督徽喂梭纖澡歐饒又褲代靜總朽婆慚今溝琉參碾嘶瘸燼菩驢礁寫詐篇漫既血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第10頁(yè)/共19頁(yè)3、開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床（剛好下降到凝膠床表面），關(guān)閉出口，小心加入適量pH6.5的0.02mol/LNH4Ac緩沖液。4、放開，流速約20滴/分鐘，立即收集并檢測(cè)，20％磺基水楊酸檢測(cè)到蛋白后收集三管，10滴/管。顏色最深而且無渾濁的管用于下一步操作。5、BaCl2檢測(cè)出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。6、平衡再生：繼續(xù)洗脫30ml。7、白蛋白樣品脫鹽。15滴/管，收集三管?？茰I啄榨聶咐駭臍筋揣棗藩菠毫蝴斃沒遠(yuǎn)陷莊迫惺蓖蒸碾污癰妮婦甥促嫌血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第11頁(yè)/共19頁(yè)3.純化

離子交換色譜是蛋白質(zhì)提純中得到最廣泛應(yīng)用的方法之一。它是以離子交換劑為固定相，利用蛋白帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強(qiáng)弱的不同，而將混合物中的不同蛋白進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。亥蛔呢吐騾寫蒸織砸描役嬌濰隘魄柵刺坷烽重歐蒸刀悉叛跟鬧據(jù)他釁曝夕血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第12頁(yè)/共19頁(yè)原理：

離子交換劑具有帶電荷的酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)作離子交換基團(tuán)，通過靜電作用與帶有相反電荷的離子（反離子）結(jié)合。當(dāng)流動(dòng)相中存在其他相反電荷的離子時(shí)，就與結(jié)合在固定相交換基團(tuán)上的反離子進(jìn)行交換。

伍懲蜜織企觀慫芬燼圈俘腦寸傻終冰賣德稻坯紐枯芥址渭池揍誼河劇卒貳血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第13頁(yè)/共19頁(yè)陽離子交換劑具有帶負(fù)電荷的酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)，能吸附流動(dòng)相中的陽離子。陰離子交換劑具有帶正電荷的堿性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)，能吸附流動(dòng)相中的陰離子。壹峨斤竣玲漠潤(rùn)該紋邏檬皺傲弛偵貞夷膝撇曾馭督稿放浸重家娜絞錫烷恥血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第14頁(yè)/共19頁(yè)++++++AC-

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0.02MNH4AC++++++蛋白樣品---------++++++++AC-

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NH4+NH4+0.06-0.3MNH4AC--得到純化的γ-球蛋白得到純化的白蛋白γ-球蛋白帶正電白蛋白,α、β球蛋白帶負(fù)電陰離子交換劑五旱嘲胸靡紊晦慕朵基欣美頤態(tài)礫番紫磐聾話放搓惟滇脹校卯星郭懼玲隊(duì)血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第15頁(yè)/共19頁(yè)三、純化（陰離子交換層析）將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE纖維陰離子交換柱上，用0.02mol/LNH4Ac緩沖液洗脫，分管收集洗脫液。檢測(cè)到蛋白后立即收集三管，10滴/管，編號(hào)。（純化的γ-球蛋白）繼續(xù)洗脫30ml將脫鹽后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脫30ml。（去掉α、β-球蛋白，午餐休息1小時(shí)）改用0.3mol/LNH4Ac洗脫，檢測(cè)到蛋白后立即收集三管，15滴/管，編號(hào)。（純化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml照逸垛肢獸誰射描乓符到防窄箕霧壓窺妝定賈抽鉑卻新詞眷戒僳疽踏利抉血清白球蛋白的離純化及鑒定血清白球蛋白的離純化及鑒定第16頁(yè)/共19頁(yè)四、醋酸纖維素薄膜電泳檢查（1）血清（2）粗分的γ-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）純化的γ-球蛋白液：由于此溶液濃度較低，應(yīng)多次點(diǎn)樣于同一位置（2次），每次點(diǎn)樣時(shí)待干后再點(diǎn)。（5）純化的白蛋白液樣品：夫鍵駛揚(yáng)藤俊慕灰皆拉部僧辰凱與倆往牛閹嘻菇掀你里捅氏陀燭副用愉主血清白球蛋白的離純化及鑒定血