研究軟腐病病原菌終極腐霉的致病機(jī)理,植物保護(hù)論文石斛屬〔Dendrobiumspp.〕是蘭科植物的第二大屬，當(dāng)下該屬在全世界共發(fā)現(xiàn)1100多種，在我們國家有76個(gè)種和2個(gè)變種。華而不實(shí)，石斛屬藥用植物金釵石斛〔D.nobileLindl〕是傳統(tǒng)珍貴中藥，被我們國家歷版藥典所收錄，以其枯燥或新鮮的莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津之成效。由于近年來石斛屬藥用植物被過度挖掘，野生資源接近干涸，石斛屬藥用植物已被國家列為一級保衛(wèi)植物名錄。隨著人們對石斛中藥材需求量的逐步增加，當(dāng)下藥用石斛屬植物人工栽培的面積不斷擴(kuò)大。然而，隨之而來的各種病害不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重阻礙了人工栽培的進(jìn)一步發(fā)展，并給種植戶帶來了宏大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表示清楚，鐘器腐霉曾在云南省導(dǎo)致大規(guī)模鼓槌石斛、球花石斛、線葉石斛莖部的腐爛。在以往的研究中，我們鑒定出金釵石斛軟腐病的病原真菌為終極腐霉。為深切進(jìn)入研究軟腐病病原菌終極腐霉的致病機(jī)理，討論其在導(dǎo)致金釵石斛軟腐病病害經(jīng)過中的機(jī)制，金釵石斛的根、莖和葉等部位發(fā)生的顯微、超微構(gòu)造變化以及病原菌在植物體內(nèi)的分布和侵染情況，本研究采用水壓片法以及掃描電鏡觀察法分別對接種終極腐霉病原菌前后金釵石斛苗的根、莖和葉的構(gòu)造變化進(jìn)行觀察，為深切進(jìn)入理解病原菌的侵染經(jīng)過，揭示其形態(tài)學(xué)特征和侵染機(jī)制，以及為更好預(yù)防和控制此病害的發(fā)生發(fā)展提供重要的理論根據(jù)。1材料與方式方法1.1材料1.1.1植物材料金釵石斛組培苗為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2主要儀器ZEISSAxioImagerA1型光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司；JSM-6510LV型掃描電子顯微鏡購自日本電子株式會社。1.2方式方法1.2.1病原菌終極腐霉對金釵石斛的致病性試驗(yàn)將剛出瓶的生長一致的株高4~6cm的新鮮金釵石斛組培苗預(yù)先栽種在裝有滅菌的栗樹皮基質(zhì)的塑料花盆內(nèi)，每個(gè)花盆栽種3株組培苗。病原菌為金釵石斛發(fā)病植株上分離得到的終極腐霉。采用孢子噴灑葉片的方式方法進(jìn)行致病性試驗(yàn)，接種的病原菌為孢子懸浮液〔1106個(gè)/ml〕，均勻地噴灑于金釵石斛幼苗的葉片上。對照組噴灑無菌水。致病組和對照組均設(shè)30個(gè)重復(fù)。接種后置于20~25℃溫室塑料膜保濕培養(yǎng)48h，然后揭去塑料膜，天天觀察植株發(fā)病情況。1.2.2常規(guī)水壓片法進(jìn)行光鏡觀察取1滴10%KOH溶液滴加到載玻片上，然后取健康的和發(fā)病48h的金釵石斛的葉片作為觀察對象，徒手切片法切取盡量薄的葉片組織，浸入KOH溶液中裝片，光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。1.2.3掃描電鏡樣品的制備流程取健康的以及發(fā)病48h的金釵石斛的根、莖、葉等部位，用于制作掃描電鏡樣品，樣品的處理按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行：2.5%戊二醛室溫下固定4~6h后，以PBS〔pH6.8，0.1mol/L〕洗滌3次，每次30min；分別經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%以及100%丙酮梯度脫水，每個(gè)梯度3次，每次30min；再經(jīng)純醋酸異戊酯置換3次，每次30min；經(jīng)CO2臨界點(diǎn)枯燥、粘樣，再經(jīng)過金離子噴濺，最后于掃描電子顯微鏡下觀察、拍照。2結(jié)果2.1光學(xué)顯微鏡觀察致病前后金釵石斛葉片顯微構(gòu)造的變化在光學(xué)顯微鏡下，正常的葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁較厚，排列規(guī)則，葉綠體分布于細(xì)胞的周邊〔圖1A〕，而發(fā)病的葉肉細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞完好性遭到毀壞，葉綠體分散、零亂〔圖1B，C〕。終極腐霉病原菌在金釵石斛葉片內(nèi)大量存在，菌絲生長旺盛，直徑可達(dá)11m，菌絲體內(nèi)充滿泡囊〔圖1C黑色箭頭所示〕，且具有流動(dòng)性，這與終極腐霉有關(guān)的形態(tài)描繪敘述相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在葉肉細(xì)胞間或內(nèi)部，卵孢子壁厚2~3m〔圖1B〕。2.2掃描電子顯微鏡觀察致病前后金釵石斛根、莖、葉構(gòu)造變化。2.2.1金釵石斛植株被病原菌侵染前后的根外表和橫切面顯微構(gòu)造由圖2能夠看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株根的外表構(gòu)造保持完好〔圖2A〕，根被細(xì)胞顯示出典型的網(wǎng)狀纖維樣構(gòu)造，皮層細(xì)胞構(gòu)造較完好，其體積明顯比根被細(xì)胞大，有較多顆粒樣物質(zhì)〔圖2B上箭頭〕，揣測為淀粉粒樣的構(gòu)造，根的中柱髓部〔圖2B下箭頭〕構(gòu)造也較完好，細(xì)胞排列規(guī)則。被病原菌侵染的金釵石斛植株根的外表分布有大量的病原菌終極腐霉的菌絲〔圖2C箭頭〕，病原菌菌絲體穿過根被死亡細(xì)胞外表的各種孔洞，在根部蔓延和穿行，交織成網(wǎng)狀，進(jìn)而深切進(jìn)入根皮層細(xì)胞，毀壞皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)胞的壞死〔圖2C，D〕，終極腐霉高密度分布是宿主植物發(fā)病的基礎(chǔ)，同時(shí)講明這種土傳植物病害病原菌終極腐霉首先必須在基質(zhì)中侵入根部組織進(jìn)而侵染其他組織導(dǎo)致植株的發(fā)病和死亡，這為我們提供了終極腐霉侵染植株直觀的顯微根據(jù)。2.2.2金釵石斛植株被病原菌侵染前后的莖外表顯微構(gòu)造由圖3能夠看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株莖外表保持完好的構(gòu)造，莖葉鞘部位細(xì)胞縱向分布，排列極其規(guī)則，散在分布有氣孔樣構(gòu)造〔圖3A〕。金釵石斛植株遭到病原菌侵染后，終極腐霉菌絲大量在莖外表穿行〔圖3B白色箭頭)、縱橫交織，使該部位的構(gòu)造完好性遭到嚴(yán)重毀壞，莖外表出現(xiàn)了大大小小的孔洞；金釵石斛莖外表的終極腐霉菌絲產(chǎn)生分支〔圖3B黑色*〕后，通過機(jī)械穿透作用進(jìn)入組織內(nèi)部〔圖3B白色*〕，后又穿行暴露于莖外表〔圖3B黑色**〕；終極腐霉菌絲出現(xiàn)不規(guī)則膨大，構(gòu)成附著胞，并牢牢地黏附在莖外表〔圖3B黑色箭頭)，并將繼續(xù)侵染植株的深部組織。2.2.3金釵石斛植株被病原菌侵染的葉反面和橫切面顯微構(gòu)造圖4A顯示未被病原菌侵染的金釵石斛植株葉部的完好構(gòu)造，橫切面能夠看到完好的維管束構(gòu)造。圖4B顯示很多終極腐霉菌絲末端膨大，縱橫排列，構(gòu)成類似吸盤的特殊構(gòu)造〔圖4B黑色箭頭〕，牢固地附著于葉反面，從多個(gè)角度和部位黏附、侵染葉反面。圖4C顯示大量病原菌菌絲從氣孔處爭相侵入寄主體內(nèi)。圖4D顯示終極腐霉菌絲在氣孔處發(fā)生斷裂后，可見很多泡囊構(gòu)造，這是終極腐霉的典型特征之一。2.2.4金釵石斛植株被病原菌終極腐霉侵染的葉外表形態(tài)構(gòu)造由圖5能夠看出，葉外表分布的病原菌菌絲體中間出現(xiàn)膨大構(gòu)成典型的孢子囊構(gòu)造〔圖5A黑色箭頭〕。圖5B示藏精器〔黑色箭頭〕和藏卵器〔白色箭頭〕的構(gòu)造，它們是終極腐霉病原菌的有性繁衍器官，核配以后構(gòu)成卵孢子進(jìn)而產(chǎn)生下一代病原菌菌絲體。圖5C示菌絲側(cè)生的孢子囊構(gòu)造，此孢子囊構(gòu)造也稱為厚垣孢子，其具有抵抗惡劣或極端環(huán)境的能力。3討論病原菌終極腐霉是全球性的重要植物病原菌，可引起多種農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的病害，給國家造成宏大的經(jīng)濟(jì)損失。終極腐霉侵染石斛屬植物的現(xiàn)象越來越普遍，當(dāng)下國內(nèi)外對終極腐霉的致病機(jī)制報(bào)道較少，侵染寄主的詳細(xì)經(jīng)過尚不明確，給該病原菌導(dǎo)致的病害的防治帶來了極大困難。以往的研究表示清楚，終極腐霉能夠產(chǎn)生多種蛋白以及纖維素酶、同工酶等細(xì)胞壁降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞壁的降解，進(jìn)而引起胡蘿卜空斑癥的發(fā)生。本研究系統(tǒng)地研究了終極腐霉感染金釵石斛前后的形態(tài)學(xué)變化，由徒手切片以及掃描電鏡觀察揣測，終極腐霉主要通過表皮、氣孔等構(gòu)造進(jìn)行機(jī)械穿透、構(gòu)成附著胞以及類似吸盤等特殊形態(tài)構(gòu)造并分泌降解酶毀壞金釵石斛細(xì)胞的細(xì)胞壁及其內(nèi)部構(gòu)造，并在細(xì)胞間延伸侵染，使根