青貯飼料質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范：青貯飼料霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了青貯飼料中霉菌毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)和高效液相色譜檢測(cè)的方法、步驟和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于青貯飼料中的霉菌毒素的檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18980乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法GB/T28716飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法GB/T28718飼料中T2毒素的測(cè)定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。酶聯(lián)免疫吸附法enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA利用抗原抗體反應(yīng)原理，將已知抗原吸附在酶標(biāo)板上，加入酶標(biāo)記抗體和樣品提取液并混合均勻，充分反應(yīng)后用去離子水洗去多余抗體，再加入酶的底物，產(chǎn)生有色物質(zhì)，最后加入終止液使反應(yīng)終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定酶底物的降解量，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中的抗原量。高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC試樣中各組分在色譜柱的流動(dòng)相和固定相間分配系數(shù)不同，在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，會(huì)反復(fù)多次吸附－脫附－放出，經(jīng)過一定柱長(zhǎng)后，彼此分離，順序離開色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的離子流信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。高壓液相色譜是把流動(dòng)相改為高壓輸送，最高輸送壓力達(dá)3.5×104kPa，色譜柱用小粒徑的填料填充的色譜分析方法。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。甲醇。石油醚。三氯甲烷。無水乙醇。乙酸乙酯。二甲基甲酰胺。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。吐溫-20。30%過氧化氫（30%H2O2）。抗T-2毒素單克隆抗體與辣根過氧化酶結(jié)合物?？乖Ｃ咕舅嘏c載體蛋白-牛血清白蛋白的結(jié)合物。ELISA緩沖液系統(tǒng)包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，稱取1.59g碳酸鈉（Na2CO3），2.93g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水稀釋至1000mL。洗液為含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液（簡(jiǎn)稱為PBS-T），配制方法為：稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g，氯化鈉（NaCl）8.0g，氯化鉀（KCl）0.2g，吐溫-200.5mL，加水至1000mL。底物緩沖液為pH5.0的磷酸－檸檬酸緩沖液，配制方法為：甲液：0.1mol/L檸檬酸（C6H8O7?H2O），即稱取檸檬酸19.2g，加水至1000mL；乙液：0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），即稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。底物溶液：取50μLTMB（10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液＋10mL底物緩沖液＋10μL30%過氧化氫，混均。霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配成1mg/mL霉菌毒素貯備液，-20℃冰箱貯存。于檢測(cè)當(dāng)天，精確吸取貯備液，用20%甲醇的PBS（配制方法PBS-T，不加吐溫-20即可）稀釋成制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的所需濃度。儀器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自來水、蒸餾水沖洗。酶標(biāo)檢測(cè)儀。酶標(biāo)板（40孔或96孔）。電動(dòng)振蕩器。電熱恒溫水浴鍋。具0.2mL尾管的10mL小濃縮瓶。測(cè)定步驟提取取樣品通過20目篩粉碎的樣品20g，置200mL具塞錐形燒瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷－無水乙醇（4：1），加塞密封，振蕩1h，通過濾紙過濾，取25mL濾液于蒸發(fā)皿中，置90℃水浴上通風(fēng)揮干。用50mL石油醚分次溶解蒸發(fā)皿中殘?jiān)?，洗?50mL分液漏斗中，再用20mL甲醇－水（4：1）分次洗滌，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中，振搖1.5min，靜置約15min，收下層甲醇－水提取液。層析凈化裝備層析柱，在層析管中先裝入0.5g中性氧化鋁，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲緊，在層析柱下端與小管相連結(jié)處塞約0.1g脫紙棉，盡量塞緊，將7.1收集的提取液層析凈化。濃縮備用將過柱后的洗脫液倒入蒸發(fā)皿中，并于水浴鍋上濃縮至干，趁熱加3mL乙酸乙酯，加熱至沸，揮干，再重復(fù)一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中。用適量乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中。將濃縮瓶置95℃水浴鍋上，揮干冷卻后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA檢測(cè)之用。ELISA檢測(cè)用霉菌毒素與載體蛋白結(jié)合物包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過夜。酶標(biāo)板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或樣品提取液（檢測(cè)樣品毒素含量）與抗體－酶結(jié)合物溶液（1：100）的混合液（1：1，每孔100μL，該混合液應(yīng)于使用的前一天配好，4℃過夜備用），置37℃1.5h。酶標(biāo)板洗3次，每次3min，加入底物溶液。每孔100μL，37℃30min。用1mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，每孔50μL，于450nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算試樣霉菌毒素濃度按式（1）計(jì)算： （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1）式中：C――酶標(biāo)板上所測(cè)得的霉菌毒素的量（ng），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；V1――樣品提取液的體積，mL；V2――滴加樣液的體積，mL；D――樣液的總稀釋倍數(shù)；m――樣品質(zhì)量，g。精密度每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。其分析結(jié)果的相對(duì)相差應(yīng)不大于20%。高效液相色譜測(cè)定技術(shù)（HPLC）試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。色譜甲醇。乙腈。石油醚。氫氧化鈉。儀器高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器。震蕩器（或高速攪拌器）。高速離心機(jī)。高壓氣泵。泵流操作架。高效液相色譜條件色譜柱：C18柱，長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5um。熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)435nm。流動(dòng)相：乙腈-水（25：75）。流速：1.0mL/min。進(jìn)樣量：20μL。柱溫：室溫。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制取霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋成0.5ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)使用需要，準(zhǔn)確吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置5mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配成相當(dāng)于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。樣品前處理稱樣預(yù)提稱取過20目篩粉碎的混勻試樣5g，置于50mL離心管中，加2mL水和30mL甲醇。勻質(zhì)提取將預(yù)提液用高速均質(zhì)器在9500r/min，高速勻質(zhì)5min，超聲提取30min。上清液收集將勻質(zhì)提取液在6000r/min下離心15min，收集上清液并移入250mL分液漏斗中。殘留物的再提取在分液漏斗中加入30mL石油醚，振搖2min；待分層后，將下層移于50mL燒杯中，棄去石油醚層。重復(fù)用石油醚提取2次。提取液濃縮將下層溶液移到100mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2mL；濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液（1+4）5mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50mL離心管中，加水稀釋至約50mL，在6000r/min下離心5min，上清液供制備測(cè)試溶液。供試樣品溶液的制備注入將免疫親和柱連接于50mL玻璃注射器，準(zhǔn)確移取50.0mL凈化測(cè)試溶液，注入玻璃注射器；將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使測(cè)試溶液以約2mL/min～3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2mL～3mL空氣通過柱體。沖洗更換10mL注射器與親和柱連接，在注射器中加入10mL水，調(diào)節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。洗脫準(zhǔn)確加入4mL色譜級(jí)乙腈洗脫，流速為1mL/min～2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。乙腈洗脫時(shí)，乙腈分2～4次加入，每次加入后，讓甲醇充分浸泡柱子里的凝膠2min，洗脫后的乙腈溶液，水浴30℃加熱吹干。定容備用將收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色譜儀測(cè)定。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精密量取1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品液各20uL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣測(cè)定精密量取供試品溶液20uL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于霉菌毒素的量。計(jì)算試樣霉菌毒素濃度按式（2）計(jì)算