動物組織標本制作技術(shù)及注意事項動物組織標本制作技術(shù)第一章：取材及固定一、動物致死法1、麻醉法第二章可將浸有乙醚或氯仿的棉球連同小動物一起密封于鐘罩或有蓋玻璃瓶內(nèi)進行麻醉；也可用4%戊巴比妥作靜脈注射，劑量按動物體重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，劑量一般按動物體重5ml/kg。2、空氣栓塞法如家兔可用50ml注射器將空氣由耳靜脈推入，使動物很快死亡。3、擊頭法如大、小鼠，可用重物擊頭后部或?qū)⑵漕^后部猛撞桌沿，最好一擊而死。4、斷頭法青蛙、小鼠等小動物，可用剪刀剪去其頭部，較大動物如兔子等，可用斧頭迅速砍頭致死。5、股動脈放血法動物經(jīng)吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切開股動脈放血。注意：上述各法，應(yīng)根據(jù)制片需要選用，如空氣栓塞法不宜用作血管注射標本的制作；乙醚麻醉對丘腦下神經(jīng)部分泌物染色標本不利；股動脈放血法有利于腸系膜鋪片的制作。二、取材注意事項1、材料新鮮最好是動物心臟還在跳動時取材，立即投入固定液內(nèi)，臟器的上皮組織最易變質(zhì)，應(yīng)爭取在死后半小時內(nèi)處理完畢。2、組織塊力求小而薄組織塊的厚度以不超過5毫米為宜，較理想的厚度為2毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均勻的滲入組織塊內(nèi)部。3、勿使組織塊受擠壓切取組織塊時刀剪要鋒利，不要來回挫動，夾取組織時切勿猛壓，取材時組織塊可稍大，以便固定后修塊。4、盡量保持組織的原有形態(tài)新鮮組織經(jīng)固定后，或多或少產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，為此可將組織展平，以盡可能維持原形。5、要熟悉取材部位要能準確的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應(yīng)取有細支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。6、動物品種的選擇如觀察肥大細胞，以大、小鼠皮下組織及腸系膜、大網(wǎng)膜鋪片為佳，欲觀察運動終板，可用小鼠的肋間肌等。7、選好組織塊的切面熟悉某些器官組織成分安排，然后決定其切面的走向；如一長管狀器官以橫切面較好。8、保持材料的清潔組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用生理鹽水沖洗，然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。9、切除不需要的部分特別是組織周圍的脂肪等，應(yīng)盡可能清除掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來一些不必要的問題。三、組織固定法（一）、固定的方法1、小塊組織固定法：從人體和動物取下的小塊組織，立即置入液態(tài)固定劑中進行固定，這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法。2、注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對整個臟器或整個動物進行固定。這時宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達整個組織和全身，從而得到充分的固定。3、蒸汽固定法:比較細小而薄的標本，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細胞涂片以及某些薄膜組織的固定。（二）、固定的目的1、迅速阻止組織、細胞的死后變化，防止自溶與腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)與結(jié)構(gòu)。2、使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其原有狀態(tài)。3、使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，以便染色后易于鑒別和觀察。4、使組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞。5、使不同組織成分對染料有不同的親和力，經(jīng)染色處理后易于辨認。6、防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。7、使組織塊硬化，便于制作薄片。（三）、注意事項及影響固定的因素1、組織塊不易過大，一般以厚度5mm，長寬不超過15×15mm。2、固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜。3、必須選擇滲透力強，又不使組織過渡收縮或膨脹的試劑作為固定液。4、有的固定劑是由氧化劑與還原劑混合而成，如甲醛（還原劑）與重鉻酸鉀（氧化劑）混合成的Helly液等。5、固定時間的長短視固定劑的不同要求而定，也與氣溫、組織塊的大小有關(guān)。溫度高時則時間縮短，組織塊過大則應(yīng)延長固定時間。6、軟組織或較大組織可先經(jīng)2-3小時固定后再修整成小塊重新投入新配制的固定液內(nèi)繼續(xù)固定。7、特殊要求的組織，常需要特殊的固定液，所以，取組織之前應(yīng)做好準備。如各種神經(jīng)組織因顯示內(nèi)容不同，需不同的固定液與固定方法。（四）、固定液1、固定液種類：一類是單純固定液，即只有一種試劑；另一類是混合固定液，由兩種或兩種以上試劑組成。作為較好的固定液，應(yīng)有下列特性，首先，有強滲透力，能迅速的滲入組織內(nèi)部；其次，不使組織過渡收縮或膨脹，并能使組織內(nèi)欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；最后，能使組織達到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強的親和力。2、單純固定液（1）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，又可作為單純固定液使用。用于固定時以80%-95%濃度為好。缺點是經(jīng)酒精固定的組織容易變硬，對組織收縮較大。（2）甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的福爾馬林，常用濃度為10%，指以10ml的商品甲醛（37%-40%甲醛水溶液）加入90ml水配成的，此液實際上只有4%的甲醛。（3）醋酸：亦名乙酸，能與酒精、水、氯仿等多種試劑混合，故為許多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小組織僅1h即可，對組織和細胞有膨脹作用，且不能凝固細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，一般與引起收縮的固定液一起使用，以達到平衡目的。（4）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白質(zhì)，對脂肪、類脂無作用，滲透力較弱，很少單獨使用，固定后收縮明顯，用含苦味酸的固定液固定組織一般不宜超過24小時。（5）重鉻酸鉀：其穿透速度快，對組織收縮小并稍有膨脹，重鉻酸鉀常備水溶液為3-5%。其混合固定液，如Zenker液、Helly液及Regaud液等被廣泛用于組織學，凡經(jīng)重鉻酸鉀、鉻酸、鉻酸鹽固定的組織，必須以流水沖洗后方能轉(zhuǎn)入脫水劑。（6）鋨酸：鋨酸一般只用于某些特殊染色或電鏡切片染色或固定，配制時要用洗滌干凈的玻塞棕色瓶，最好用雙蒸水配制，鋨酸穿透力弱，且易使組織硬脆，因此它固定的組織必須小而薄，體積最好在3×3×2mm以內(nèi)。（7）鉻酸：鉻酸能沉淀蛋白質(zhì)，適用于核蛋白的固定，并能增強核的染色能力，穿透速度慢，一般組織塊的固定，需經(jīng)12-24h，硬化程度中等，收縮顯著，除用作固定液外，萬分之一的鉻酸水溶液，可制作分離標本。（8）丙酮：丙酮能使蛋白質(zhì)沉淀，滲透力強，但對核固定欠佳，且使組織劇烈收縮。廣泛用于組織化學中酶的固定，其作用基本與酒精相同。（9）三氯醋酸：作用與醋酸相似，很少單獨使用，在混合固定液中對組織起膨脹作用。3、常用混合固定液（1）Bouin液：飽和苦味酸水溶液：75ml；甲醛水溶液（40%）：25ml；冰醋酸：5ml。三者在配方中的實際比例為1：5：15，為實驗室常用固定劑，其滲透力強，對組織固定均勻且收縮較小，染色效果好。冰醋酸固定染色質(zhì)，苦味酸使組織適當硬化，甲醛水溶液調(diào)節(jié)兩種試劑對組織的膨脹作用。其固定時間以12-24h為宜。（2）Carnoy液：冰醋酸一份，氯仿三份，無水酒精六份。此液浸透速度快，固定時間不宜過長，小塊組織2-3小時即可，固定后直接入無水酒精脫水。常用于糖原及尼氏體固定。一般固定時須放在冰箱中，低