脂質(zhì)組學(xué)分析的主要儀器方法,生物化學(xué)論文脂類化合物通常被定義為自然界中存在的一類難溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的小分子化合物，是生物體內(nèi)非常重要的物質(zhì)。作為構(gòu)成生物膜的主要成分，脂類化合物具有分子多樣性和多種生物功能，包括為蛋白質(zhì)互相作用提供適宜的環(huán)境、儲存能量、作為重要的信使分子等。國際脂質(zhì)分類和命名委員會〔InternationalLipidClassificationandNomencla-tureCommittee〕給出的脂質(zhì)類化合物定義為：全部和部分來自基于負(fù)碳離子的硫酯縮合〔脂肪酰類、甘油脂類、甘油磷脂類、鞘脂類、糖脂類和聚酮化合物〕和/或基于正碳離子的異戊二烯縮合〔異戊烯醇類和固醇類〕的疏水性或兩性小分子[1].這一定義將脂類化合物分為8大類型，每個類型又可根據(jù)極性頭基的不同分為不同的亞類，每一亞類又可進(jìn)一步根據(jù)碳鏈的長度和不飽和度細(xì)分為不同的分子種屬，這就構(gòu)成了脂類化合物的三級分類系統(tǒng)。脂質(zhì)代謝通路戰(zhàn)略〔LIPIDMAPS〕聯(lián)合會也采用這一定義[2],當(dāng)前LIPIDMAPS的數(shù)據(jù)庫中包含了4萬多個脂類化合物[3].脂類化合物與細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)、疾病感染、免疫功能，以及胎兒代謝缺陷都密切相關(guān)[1],脂類化合物的代謝還與糖尿病[4]、肝癌[5]、腎病[6]、乳腺癌[7]密切相關(guān)。隨著研究的深切進(jìn)入和各種組學(xué)的出現(xiàn)，有關(guān)學(xué)者于2003年提出了脂質(zhì)組學(xué)〔lipido-mics〕的概念[8].所謂脂質(zhì)組學(xué)就是對脂質(zhì)分子種屬及其生物功能的全面描繪敘述，主要研究與蛋白質(zhì)表示出有關(guān)的脂質(zhì)代謝及其功能[9].因而，脂質(zhì)組學(xué)的研究屬于生命科學(xué)的范疇，與人類的健康密切相關(guān)。當(dāng)前，脂質(zhì)組學(xué)已成為代謝組學(xué)最重要的分支之一，且是一個非?；顫娵x躍的研究領(lǐng)域，尤其在疾病研究方面的重要性已經(jīng)引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注[10],論文發(fā)表數(shù)量逐年增加〔見圖1〕。近期有科研人員研究了肥胖癥[11]、動脈粥樣硬化[12]、腦脊髓液[13]、代謝綜合征[14]和腦癌[15]的脂質(zhì)組學(xué)。植物脂質(zhì)組學(xué)的研究也有報(bào)道[16].隨著特定的脂類生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)以及新的數(shù)據(jù)處理軟件的發(fā)展，脂質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中已被用于藥物活性和治療效果的評價以及某些疾病的早期診斷[10].2脂質(zhì)組學(xué)分析的主要儀器方式方法脂質(zhì)組學(xué)是典型的穿插學(xué)科，圖2是其研究工作流程[1].一般分為3步：〔1〕明確生物醫(yī)學(xué)問題；〔2〕脂質(zhì)組學(xué)分析，包括取樣和樣品制備、分離鑒定和數(shù)據(jù)處理；〔3〕結(jié)果解析，獲得脂類化合物相關(guān)的圖2脂質(zhì)組學(xué)研究工作流程Fig.2Workflowoflipidomicsresearch代謝通路，挑選生物標(biāo)志物。華而不實(shí)非常重要的部分是脂質(zhì)組學(xué)分析，它為最終研究結(jié)果提供關(guān)鍵的數(shù)據(jù)。生物功能解析則要借助于生物信息學(xué)、病理學(xué)、臨床數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)軟件等工具來實(shí)現(xiàn)。脂類化合物種類繁多，生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，故脂質(zhì)組學(xué)分析需要借助先進(jìn)的分離技術(shù)和檢測手段。當(dāng)前主要采用各種色譜技術(shù)，包括薄層色譜〔TLC〕法、氣相色譜〔GC〕法、毛細(xì)管電泳〔CE〕法、超臨界流體色譜〔SFC〕法、高效液相色譜〔HPLC〕法和各種質(zhì)譜〔MS〕技術(shù)，以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。核磁共振〔NMR〕、紅外光譜和拉曼光譜用得較少，主要原因是這些技術(shù)的分離能力有限，對脂類化合物的檢測靈敏度尚不能令人滿意，且定性能力也不強(qiáng)[17,18].脂質(zhì)組學(xué)分析主要牽涉樣品處理、輪廓分析、目的分析、成像分析，以及數(shù)據(jù)處理。下面主要圍繞色譜和質(zhì)譜技術(shù)來討論脂質(zhì)組學(xué)分析中的儀器和方式方法。2.1樣品處理〔samplepreparation〕脂類化合物的分析首先要從復(fù)雜的基質(zhì)中將脂類物質(zhì)提取出來，以保證后續(xù)分析的成功。全脂質(zhì)化合物的最常用提取方式方法是Folch等[19]提出的氯仿甲醇提取法。近年來也有改良這一方式方法的報(bào)道[20-22].改良的方式方法在一定程度上縮短了提取時間，提高了某些脂類化合物的提取效率，但是樣品處理通量還是不能令人滿意。因而，近年來人們也在研究用固相萃取〔SPE〕、微波輔助提取〔MAE〕、超臨界流體萃取〔SFE〕和加壓流體萃取〔PFE〕等技術(shù)來處理脂類樣品[23],以期借助自動化提高樣品處理通量?？傊?，當(dāng)前脂類化合物分析中樣品處理還是多用傳統(tǒng)的液液萃取方式方法，由于這些萃取方式方法對大部分脂類化合物有較好的萃取效率。自動化萃取多用儀器方式方法，固然萃取時間能夠大為縮短，但對不同脂類化合物的普適性還有待提高，這方面仍然需要進(jìn)一步研究。2.2輪廓分析〔profilinganalysis〕輪廓分析或非目的分析〔untargetedanalysis〕也叫全脂分析〔globalanalysis〕，即對生物樣品中所有的脂類化合物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，以便從中挑選生物標(biāo)志物。此種分析主要是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方式方法。早期多用TLC〔以及TLC-MS〕和GC〔以及GC-MS〕，但前者分離效率低，后者需要對脂類化合物進(jìn)行衍生化處理，分析步驟復(fù)雜而耗時，現(xiàn)已較少使用。而LC-MS則越來越多地用于脂質(zhì)組學(xué)分析，這是由于LC的形式多，合適復(fù)雜的脂類化合物的分離，且無需衍生化；加之MS技術(shù)發(fā)展迅速，各種高分辨MS和串聯(lián)MS〔常使用MS/MS〕，以及與LC的接口〔主要是電噴霧〕的商品化，使得LC-MS具備了卓越的分離和鑒定能力[24].尤其是二維液相色譜〔2DLC〕技術(shù)可獲得上萬的峰容量，更是成為輪廓分析的首選。在各種2DLC中，正相〔NP〕LC和反相〔RP〕LC的聯(lián)用最具優(yōu)勢，由于NPLC作為第一維能夠根據(jù)分子的極性〔頭基〕不同將脂質(zhì)化合物分為大類，第二維的RPLC則根據(jù)分子的疏水性〔脂肪酸鏈〕不同而分離同一類脂質(zhì)化合物中不同種屬的分子[25].由于NPLC的流動相是有機(jī)溶劑，而RPLC則用水相流動相，二者是不互溶的，采用真空蒸發(fā)接口[26]連接NPLC和RPLC能夠獲得較為理想的結(jié)果。然而，當(dāng)前2D〔NP/RP〕LC-MS/MS采用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的接口，自動化水平和分析重現(xiàn)性均有待提高，分析時間較長。因而，開發(fā)更完善、更有效的2D〔NP/RP〕LC接口，實(shí)現(xiàn)高通量自動分析是一個重要的研究課題。除此之外，采用MS直接分析的鳥槍脂質(zhì)組學(xué)法〔shotgunlipidomics〕也用于輪廓分析[27,28],其特點(diǎn)是分析速度快、鑒定能力強(qiáng)，但缺乏也比擬明顯：一是儀器價格昂貴，為保證定性準(zhǔn)確性，需要用高分辨甚至超高分辨MS;二是脂質(zhì)成分信息缺失，鳥槍法中全脂未經(jīng)色譜分離即在離子源電離，導(dǎo)致低豐度和難電離脂質(zhì)成分的電離遭到明顯抑制，造成相關(guān)脂質(zhì)無法檢出；三是脂質(zhì)構(gòu)造信息缺失，異構(gòu)體在生物體內(nèi)的作用可能存在明顯差異，準(zhǔn)確鑒定就顯得尤為重要，單獨(dú)采用MS的鳥槍法很難區(qū)分某些脂質(zhì)異構(gòu)體〔如位置異構(gòu)和對映異構(gòu)〕，而2DLC-MS/MS能夠分離并定性定量分析這些異構(gòu)體[5,25].2.3目的分析〔targetedanalysis〕目的分析即針對幾種、一類或少數(shù)幾類脂質(zhì)化合物〔如生物標(biāo)志物〕進(jìn)行分析。目的分析要求速度快、定性定量準(zhǔn)確。直接MS分析和RPLC是常用方式方法，十分是超高效LC〔UHPLC〕與MS聯(lián)用方式方法分離效率高、分析速度快。對于原位分析或者活體分析，敞開式離子化質(zhì)譜〔AMS〕是一種很有潛力的技術(shù)。比方，聲波輔助噴霧離子化〔EASI〕-MS能夠原位分析活體藍(lán)細(xì)菌外表的典型脂類代謝產(chǎn)物[29].作者[29]選擇單細(xì)胞Synechocystissp.PCC6803、多細(xì)胞Anabaenasp.PCC7120和單細(xì)胞Synechococcussp.PCC70023種不同的藍(lán)細(xì)菌為模型微生物，采用EASI-MS對其外表的脂類化合物進(jìn)行檢測。對所獲得的MS數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析〔PCA〕，發(fā)現(xiàn)了脂類的含量與藍(lán)細(xì)菌生長狀態(tài)之間的有機(jī)聯(lián)絡(luò)。在質(zhì)譜負(fù)離子形式下，硫代異鼠李糖甘油二酯〔SQDG〕和磷脂酰甘油〔PG〕是響應(yīng)最強(qiáng)的兩種脂類。通過進(jìn)一步對兩種脂類化合物進(jìn)行目的分析，證明SQDG/PG的含量比會從藍(lán)細(xì)菌生長指數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期時急劇升高。這樣，就能夠用EASI-MS快速表征藍(lán)細(xì)菌的生長期。通過基因操縱技術(shù)對藍(lán)細(xì)菌膜內(nèi)脂類進(jìn)行改變，驗(yàn)證了EASI-MS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映藍(lán)細(xì)菌膜內(nèi)