種子檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（種科、農(nóng)學(xué)專業(yè)適用）種子科學(xué)與工程教研室2015.4實(shí)驗(yàn)一種子凈度分析一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求學(xué)習(xí)凈種子、其他植物種子和雜質(zhì)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，掌握種子凈度檢驗(yàn)程序與方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用品.實(shí)驗(yàn)材料水稻、玉米、小麥、蔬菜、牧草或其他當(dāng)?shù)爻Ｒ娮魑锓N子。實(shí)驗(yàn)用品凈度分析臺、風(fēng)選凈度儀、分樣器、不同孔徑的套篩、電動篩選器、吹風(fēng)機(jī)、雙目顯微鏡、手持（臺式）放大鏡、瓷盤、感量為1.0,0.1,0.01,0.001g和0.0001g的不同天平、直尺、鑷子、標(biāo)簽、稱量紙、記載本、鉛筆等。三、 實(shí)驗(yàn)的方法步驟送驗(yàn)樣品的稱重和重型混雜物的檢查⑴將送驗(yàn)樣品倒在天平上稱重，得出送驗(yàn)樣品重量M。⑵重型混雜物是指在大小或重量方面明顯大于被檢作物種子的混雜物。如果送驗(yàn)樣品中有重型混雜物，應(yīng)先挑出來并稱重，再分為其他植物種子和雜質(zhì)。做法是將送驗(yàn)樣品倒在光滑的瓷盤中，挑出重型混雜物，在天平上稱重，得到重型混雜物的重量m，再將重型混雜物分成其他植物種子和雜質(zhì)分別稱重，得到m1和m2。.試驗(yàn)樣品的分取⑴將除去重型混雜物的送驗(yàn)樣品混勻，從中分取試驗(yàn)樣品l份，或半試樣2份，試樣或半試樣的重量參見表3-1。如水稻種子1份全試樣是40g，兩份半試樣分別為20g。分樣可使用分樣器或采用四分法。⑵用天平稱出試樣或半試樣的重量，按規(guī)定留取小數(shù)位數(shù)［參見表3-1］。試樣的分析與分離將（半）試樣倒在凈度分析臺或平整光滑的實(shí)驗(yàn)臺桌面上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)將（半）試樣分離成凈種子、其他植物種子和雜質(zhì)三部分。試樣的分離也可借助放大鏡、不同孔徑的套篩、吹風(fēng)機(jī)等器具，在不損傷發(fā)芽率的基礎(chǔ)上進(jìn)行。借助不同孔徑的套篩的分離方法為：選用篩孔適當(dāng)?shù)膬蓪犹缀Y，要求小孔篩的孔徑小于所分析的種子，而大孔篩的孔徑大于所分析的種子。使用時(shí)將小孔篩套在大孔篩的下面，再把篩底盒套在小孔篩的下面，倒入（半）試樣，加蓋，置于電動篩選機(jī)上或手工篩動2min。篩理后將各層篩及底盒中的分離物分別倒在凈度分析臺上進(jìn)行分析鑒定，區(qū)分出凈種子、其他植物種子、雜質(zhì)，并分別放入小碟內(nèi)。各分揀成分的稱重將每份（半）試樣的凈種子、其他植物種子、雜質(zhì)分別稱重，稱量的精確度與試樣稱重要求相同。其中，其他植物種子還應(yīng)分種類計(jì)數(shù)。.結(jié)果計(jì)算⑴檢查分析過程中重量增失不管是1份試樣還是2份半試樣，應(yīng)將分析后的各種成分重量之和與（半）試樣原始重量比較，核對分析期間物質(zhì)的增失是否符合要求。若增失量超過原始重量的5%，則必須重新進(jìn)行分析，填報(bào)重做的結(jié)果。⑵以三種成分的重量之和為基數(shù)計(jì)算試樣（半試樣）中凈種子、其他植物種子及雜質(zhì)的百分率。若為全試樣，各種組分的百分率應(yīng)計(jì)算到1位小數(shù)，若為半試樣，則各種組分的百分率計(jì)算到2位小數(shù)。⑶求出2份（半）試樣間三種成分的各平均百分率及重復(fù)間相應(yīng)百分率差值，并核對容許差距（表3-2），若樣間三種成分的重量百分率都在容許范圍之內(nèi)，則它們的平均數(shù)分別為P]OS1和I/⑷含重型混雜物的結(jié)果計(jì)算凈種子：P2（%）tP1*其它植物種子：OS（%）=OSxM—m+2x1002iMM雜質(zhì).I（%）=IxM-m+mx1002 1MM上式中：M一送驗(yàn)樣品的重量，g；m一重型混雜物的重量，g；m一重型混雜物中的其它植物種子重量，g;m2一重型混雜物中雜質(zhì)的重量，g;烏一除去重型混雜物后的凈種子重量百分率，%;OS1—除去重型混雜物后的其它植物種子重量百分率，%；I1—除去重型混雜物后的雜質(zhì)重量百分率，％。⑸百分率的修約若得到的百分率取兩位小數(shù)，則應(yīng)按“四舍六入五留雙”的規(guī)則保留1位。各成分的百分率相加應(yīng)為100.0%，如為99.9%或100.1%，則在最大的百分率上加上或減去不足或超過之?dāng)?shù)。如果此修約值大于0.1%，則應(yīng)該檢查計(jì)算上有無差錯(cuò)。.其他植物種子數(shù)目的測定⑴將取出（半）試樣后剩余的送驗(yàn)樣品按要求取出相應(yīng)的數(shù)量或全部倒在凈度分析臺或平整光滑的實(shí)驗(yàn)臺桌上或樣品盤內(nèi)，逐粒進(jìn)行觀察，找出所有的其他植物種子或指定種的種子并計(jì)數(shù)出每個(gè)種的種子數(shù)，再加上（半）試樣中相應(yīng)的種子數(shù)。⑵結(jié)果計(jì)算?？芍苯佑脵z出的種子粒數(shù)來表示，也可折算為每單位試樣重量（通常用每千克）內(nèi)所含種子數(shù)來表示。.填寫凈度分析的結(jié)果報(bào)告單凈度分析的最后結(jié)果精確到1位小數(shù)，如果某種成分的百分率低于0.05%，則填為微量，如果某種成分結(jié)果為零，則須填報(bào)“一0.0—”。最后應(yīng)注意完成種子凈度分析后，應(yīng)將凈種子留下供其他項(xiàng)目檢驗(yàn)利用。四、作業(yè)每2人1組，按種子凈度分析程序與方法進(jìn)行一份供驗(yàn)種子樣品的凈度分析，并將本組凈度分析結(jié)果與鄰組同學(xué)進(jìn)行容許差距分析，如果容許誤差大于國家標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)分析其原因，重新核算或重新進(jìn)行分析。將供驗(yàn)樣品凈度的檢驗(yàn)結(jié)果，填入種子凈度分析記載表（表附-1）。

表附-1種子凈度分析記載表樣品編號作物名稱品種(組合)名稱送驗(yàn)樣品重(g)重型混雜物重(g)重型混雜物中其他植物種子重(g)重型混雜物中雜質(zhì)重(g)類別重復(fù)試樣重(g)凈7種子其他植物種子雜質(zhì)各成分重量之和重量(g)百分?jǐn)?shù)(%)重量(g)百分?jǐn)?shù)(%)重量(g)百分?jǐn)?shù)(%)全試樣半試樣12平均實(shí)際差(%)容許誤差(%)其他植物種子名稱及個(gè)數(shù)雜質(zhì)種類凈度分析結(jié)果凈種子(%)其他植物種子(%)雜質(zhì)(%)檢測依據(jù)說明：全試樣或半試樣只需選擇其中一種方法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)二種子發(fā)芽試驗(yàn)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過本實(shí)驗(yàn)掌握水稻、小麥、玉米、油菜、大豆等種子的發(fā)芽條件，學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)和快速發(fā)芽試驗(yàn)的方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具.材料水稻、小麥、大麥、玉米、油菜、大豆等作物種子。用具發(fā)芽箱、出糙機(jī)、透明塑料發(fā)芽盒、玻璃培養(yǎng)皿、發(fā)芽紙或?yàn)V紙、砂、鑷子、標(biāo)簽、數(shù)種儀（板）等。三、 實(shí)驗(yàn)的方法步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)1.發(fā)芽床的選用一般大粒種子（玉米、大豆等）用砂床（0.05?0.8mm的細(xì)砂），中粒種子（水稻、小麥、大麥等）用砂床或紙床，小粒種子（油菜、芝麻等）用紙床。發(fā)芽床的準(zhǔn)備取塑料發(fā)芽盒或發(fā)芽皿4套。將砂（石英砂或河砂）用0.8mm篩孔的鋼絲網(wǎng)篩進(jìn)行篩理，經(jīng)洗滌后與玻璃培養(yǎng)皿等一起進(jìn)行高溫消毒（160°C,2h或120C，4h）。然后在發(fā)芽皿中放入4層發(fā)芽紙（或?yàn)V紙）并加水濕透，或放入消毒砂（每100g加水約20ml）。試樣的數(shù)取取經(jīng)凈度檢驗(yàn)的凈種子400粒（水稻種子需要預(yù)先在30C溫水中浸種24h），每重復(fù)100粒，播于紙床或砂床中。播種時(shí)種子分布要均勻，彼此之間保留一定距離，用砂床時(shí)應(yīng)將種子輕輕壓入砂中，種子與砂相平，然后加蓋。貼標(biāo)簽將發(fā)芽盒或發(fā)芽皿貼上標(biāo)簽，注明品種名稱、重復(fù)號、處理溫度、置床日期、測定人姓名等，并登記在發(fā)芽試驗(yàn)記載表上。培養(yǎng)將發(fā)芽盒或發(fā)芽皿放入規(guī)定溫度和光照條件的發(fā)芽箱內(nèi)發(fā)芽?？筛鶕?jù)農(nóng)作物種子的發(fā)芽技術(shù)規(guī)定選擇恒溫或變溫處理，以后每日檢查溫度和水分。水分不足時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充，并保持發(fā)芽箱內(nèi)溫度和水分與要求一致。管理發(fā)芽床上如有種子表面生霉，可取出用清水洗滌后再放回發(fā)芽床上；如已經(jīng)霉?fàn)€，則應(yīng)從發(fā)芽床上取出并登記。如霉?fàn)€種子達(dá)5%以上，應(yīng)更換發(fā)芽床或進(jìn)行種子消毒后重新試驗(yàn)。幼苗鑒定每株幼苗都必須按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，鑒定要在幼苗主要構(gòu)造發(fā)育到一定時(shí)期進(jìn)行。每個(gè)種的試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間詳見表4-1。到達(dá)初次計(jì)數(shù)天數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)正常幼苗，并將發(fā)育良好的正常幼苗從發(fā)芽床中揀出；對可疑的或損傷、畸形或不均衡的幼苗，通常到末次計(jì)數(shù)。嚴(yán)重腐爛的幼苗應(yīng)從發(fā)芽床中除去，并隨時(shí)增加計(jì)數(shù)。末次計(jì)數(shù)時(shí)，按正常幼苗、不正常幼苗、新鮮不發(fā)芽種子或硬實(shí)和死種子分別計(jì)數(shù)和記載。如果樣品在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只有幾粒種子開始發(fā)芽，則試驗(yàn)時(shí)間可延長7d，或延長規(guī)定時(shí)間的一半。根據(jù)試驗(yàn)情況，可增加計(jì)數(shù)的次數(shù)。反之，如果在規(guī)定時(shí)間結(jié)束前，樣品已達(dá)最高發(fā)芽率，則該試驗(yàn)可提前結(jié)束。結(jié)果計(jì)算根據(jù)試驗(yàn)記錄分別計(jì)算正常幼苗、不正常幼苗、新鮮不發(fā)芽種子或硬實(shí)、死種子百分率。如果一個(gè)試驗(yàn)的四次重復(fù)正常幼苗百分率在最大容許

差距范圍內(nèi)，則其平均值表示試驗(yàn)樣品的發(fā)芽率。其余成分的百分率按四次重復(fù)平均數(shù)計(jì)算。種子發(fā)芽試驗(yàn)記載表見表附-2.表附-2種子發(fā)芽試驗(yàn)記載表樣品登記號作物名稱品種（組合）名稱檢測依據(jù)重復(fù)日期IIIIIIIV結(jié)果%發(fā)芽床 溫度 °C置床日期 實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間-天發(fā)芽前處理方法正不死正不死正不死正不死容許誤差 實(shí)際誤差 不正常幼苗種類正常幼苗（正）新鮮不發(fā)芽種子硬實(shí)不正常幼苗（不）死種子（死）檢驗(yàn)員： 日期： 校核人：日期： 審核人： 日期:四、作業(yè)四人一組，選擇一種作物種子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)和快速發(fā)芽試驗(yàn)，并比較兩種方法測定的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)六種子生活力的四唑染色測定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求了解四唑染色快速測定種子生活力的原理。掌握四唑染色快速測定主要作物種子生活力的方法和種子生活力有無的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具.材料小麥、玉米、水稻、大豆、棉花、蔬菜等作物種子。.器材培養(yǎng)箱、鑷子、解剖針、刀片、吸水紙等。.試劑紅四氮唑、磷酸緩沖液、乳酸苯酚透明液、過氧化氫等。三、 實(shí)驗(yàn)的方法步驟小麥、玉米種子四唑染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在30°C水中3?4h或濕潤的紙間12h，沿種胚縱切，各取半粒放入小培養(yǎng)皿或小燒杯中，倒入0.1%四唑鹽溶液淹沒種子，35C染色0.5?1h，計(jì)算生活力。水稻種子四哩染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，去殼，放在30C水中或濕潤的紙間12h，沿種胚縱切，各取半粒放入小培養(yǎng)皿或小燒杯中，倒入0.1%四唑溶液淹沒種子，35C染色1?2h，計(jì)算生活力。大豆種子四唑染色測定機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在濕毛巾間12h，剝?nèi)シN皮，放入小培養(yǎng)皿或小燒杯中，倒入1%四唑液淹沒種子，35C染色2?3h，計(jì)算生活力。棉花種子四唑染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在濕潤的紙間預(yù)濕，30C12h，縱切一半種子，或剝?nèi)シN皮，放入小培養(yǎng)皿或小燒杯中，倒入0.5%四唑液淹沒種子，35C染色2?3h，計(jì)算生活力。高粱種子四唑染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在30C水中3?4h或濕潤的紙間12h，縱切種胚，放入小培養(yǎng)皿或小燒杯中，倒入0.1%四唑液淹沒種子，35C染色0.5?1h，計(jì)算生活力。辣椒、茄子和番茄種子四哩染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在20C-30C水中3?4h或濕潤的紙間12h，在種子中心刺破種皮和胚乳或縱切種子使胚露出或撕開胚乳使胚露出，倒入0.2%四唑液淹沒種子，35C染色0.5?1.5h，計(jì)算生活力。黃瓜、西瓜和南瓜種子四哩染色測定隨機(jī)數(shù)取凈種子100粒，2次重復(fù)，放在20C-30C水中6?8h或濕潤的紙間24h，縱切種子、剝?nèi)シN皮和內(nèi)膜，倒入1%四唑溶液淹沒種子，35C染色1?2h，計(jì)算生活力。四、作業(yè)分析無生活力種子種胚不染色的可能原因。實(shí)驗(yàn)四蛋白質(zhì)電泳鑒定玉米種子純度一、 實(shí)驗(yàn)的目的與要求學(xué)習(xí)、掌握蛋白質(zhì)電泳法鑒定玉米品種純度的基本原理、操作步驟和電泳譜帶鑒定標(biāo)準(zhǔn)。二、 實(shí)驗(yàn)的材料與用具1.材料玉米十種子儀器設(shè)備電泳儀、電泳槽、離心機(jī)、離心管、感量).001g的電子天平或分析天平、樣品鉗或單粒種子粉碎器、存放試劑的廣口瓶、移液管及移液管架瓶、吸耳球、滴瓶、微量進(jìn)樣器、注射器、研缽等。試劑試劑：丙烯酰胺(Acr),甲叉雙丙烯酰胺(Bis),KOH,過硫酸胺(AP),冰乙酸，四甲基乙二胺(TEMED),甘氨酸，三氯乙酸，考馬斯亮蘭R250,無水乙醇，甲基綠。所有試劑為分析純級。三、溶液的配制1號：90g丙烯酰胺(Acr)+3g甲叉雙丙烯酰胺(Bis)加水溶解并定容至500ml2號：60g脲加水溶解并定容至200ml3號：48ml1mol/L的KOH+17.2ml乙酸加水定容至100ml4號：48ml1mol/L的KOH+2.9ml乙酸加水定容至100ml5號：四甲基乙二胺(TEMED)原液6號：10%過硫酸胺電極液：甘氨酸0.44g加水溶解+4.5ml乙酸再加水定容至1100ml指示劑：0.1%甲基綠水溶液染色劑：10%三氯乙酸200ml+1%考馬斯亮蘭乙醇溶液10ml提取液：80g月尿+80ml乙酸+加水定容至500ml四、操作步驟蛋白質(zhì)提取:將每粒種子樣品用單粒粉碎器磨碎后倒入1.5m】離心管中，加入適量提取液，靜置0.5小時(shí)以上或5000rpm離心15分鐘，上清液即可點(diǎn)樣。凝膠室的制作:將預(yù)先洗凈晾干的玻璃板裝入膠條中，配濃縮膠溶液封好底縫，并把膠條固定在電泳槽中，保持水平，擰緊螺栓。灌分離膠:依次取1號22.5ml、2號5ml、3號3.75ml、6號1.6ml、5號0.2ml混合后倒入制好的膠室至距頂端2cm左右為止，約20-30分鐘膠可聚合，吸去析出水分。灌濃縮膠:依次取1號3ml、2號2ml、4號5ml、6號0.3ml、5號0.04ml混合后倒在分離膠上，并插入梳子，約10-20分鐘，待濃縮膠聚合后輕輕拔出梳子，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。點(diǎn)樣：用微量進(jìn)樣器取每粒種子樣品的上清液15-20〃l注入濃縮膠上的凹穴內(nèi)，每點(diǎn)完一粒樣后要清洗進(jìn)樣器。電泳:加樣完畢后，小心倒入電極液，并在上槽加入3-4滴甲基綠指示劑，接通電源，穩(wěn)壓180V，約需2-2.5小時(shí)。染色:將電泳后的凝膠放入染色液中，在30°C恒溫條件下染色約需2-3小時(shí)。五、 觀察鑒定在白瓷盤上對比鑒定的種子和已知真實(shí)種子或父母本的蛋白譜帶來鑒定品種，根據(jù)雜交種的數(shù)量計(jì)算出純度，同時(shí)也可將異交種和自交粒數(shù)統(tǒng)計(jì)出來。六、 結(jié)果保存結(jié)果保存的方式有多種，最簡便的方式為濕法保存膠板和照相。濕法保存用7%乙酸溶液浸泡膠板，然后將膠板放人塑料袋中，用家用保鮮熱合機(jī)密封，該保存條件在室溫下可保存半年以上，缺點(diǎn)是不小心易碰破膠板。在保存過程中如出現(xiàn)譜帶變淺可將膠板取出重新放人染色液染色。照相凝膠板拍照，難度較大，要想得到較好效果的照片，必須采用大型翻拍機(jī)。實(shí)驗(yàn)五玉米品種鑒定SSR標(biāo)記法一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過本實(shí)驗(yàn)，了解SSR標(biāo)記法鑒定玉米的基本原理，掌握SSR標(biāo)記法鑒定玉米品種的操作方法和鑒定標(biāo)準(zhǔn)。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具材料玉米種子、幼苗、葉片、苞葉、果穗等組織或器官。儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀、高壓電泳儀（規(guī)格為3000V、400mA、400W，具有恒電壓、恒電流和恒功率功能）、垂直電泳槽及配套的制膠附件、普通電泳儀、水平電泳槽及配套的制膠附件、高速冷凍離心機(jī)（最大離心力不小于15,000rpm）、水平搖床、膠片觀察燈、電子天平（感應(yīng)為0.01g、0.001g）、微量移液器（規(guī)格分別為10RL、20rL、100rL、200rL、1000rL，連續(xù)可調(diào)）、磁力攪拌器、紫外分光光度計(jì)（波長260nm及280nm）、微波爐、高壓滅菌鍋、酸度計(jì)、水浴鍋或金屬?。販鼐取?°C）、冰箱（最低溫度-20°C）、制冰機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀、DNA分析儀、基于毛細(xì)管電泳，有片段分析功能和數(shù)據(jù)分析軟件，能夠分辨1個(gè)核苷酸大小的差異。試劑十六烷基三乙基漠化銨（CTAB）、三氯甲烷、異丙醇、異戊醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、鹽酸（37%）、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉、10XBuffer緩沖液（含Mg2+25mmol/L）四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP，每種10mmol/L）、TaqDNA聚合酶、礦物油、瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、核酸染色劑、去離子甲酰胺（Formamide）、漠酚藍(lán)（BrphBlue）、二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺（bisacrylamide）、丙烯酰胺（acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、親和硅烷（BindingSilane）、剝離硅烷（RepelSilane）、無水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、冰醋酸、乙酸銨、硝酸銀、甲醛、DNA分析儀專用丙烯酰胺膠液、DNA分析儀專用分子量內(nèi)標(biāo)Liz標(biāo)記、DNA分析儀專用電泳緩沖液。三、溶液配制（一）DNA提取溶液的配制1.0.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固體NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。2.1mol/LTris-HCl溶液60.55gTris堿溶于適量水中，^口HCl調(diào)pH至8.0，定容至500mL，高壓滅菌。3.0.5mol/LHCl溶液25mL濃鹽酸（36-38%），加水定容至500mL。CTAB提取液81.7g氯化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL，4C貯存。5.SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL,0.5mol/LEDTA50mL,5mol/LNaCl50mL,SDS7.5g，定容至500mL。6.TE緩沖液1mol/LTris-HCl5mL,0.5mol/LEDTA1mL,加HCl調(diào)pH至8.0，定容至500mLo7.5mol/LNaCl溶液146g固體NaCl溶于水中，加水定容至500mL。（二） PCR擴(kuò)增溶液的配制l.dNTP用超純水分別配制A、G、C、T終濃度100mmol/L的儲存液。各取20p匚混合，用超純水720pL定容至每種終濃度2.5mmol/L的工作液。2.SSR引物用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均40pmol/L的儲存液，等體積混合成20pmol/L的工作液。注：干粉配制前應(yīng)首先快速離心。3.6X加樣緩沖液去離子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，漠酚蘭0.125g，二甲苯青0.125g。（三） 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制1.40%PAGE膠丙烯酰胺190g和甲叉雙丙烯酰胺10g，定容至500mL。2.4.5%PAGE膠尿素450g，10XTBE緩沖液100mL，40%PAGE膠112.5mL，定容至1000mL。Bind緩沖液49.75mL無水乙醇和250pL冰醋酸，加水定容至50mL。親和硅烷工作液在1mLBind緩沖液中加入5pLBind原液，混勻。剝離硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。6.25%過硫酸銨溶液0.25g過硫酸鉉溶于1mL超純水中。7.10XTBE緩沖液Tris堿108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。8.1XTBE緩沖液10XTBE緩沖液500mL，加水定容至5000mL。（四） 銀染溶液的配制1.固定液100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。染色液2g硝酸銀，加水定容至1000mL。顯影液1000mL蒸餾水中加入30g氫氧化鈉和5mL甲醛。注：除銀染溶液的配制可使用符合GB/T6682規(guī)定的三級水外，試驗(yàn)中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682規(guī)定的一級水。四、操作程序（一）樣品制備送驗(yàn)樣品可為種子、幼苗、葉片、苞葉、果穗等組織或器官。對玉米自交系和單交種，隨機(jī)數(shù)取至少20個(gè)個(gè)體組成的混合樣品進(jìn)行分析，或直接對至少5個(gè)個(gè)體單獨(dú)進(jìn)行分析;對于其它雜交種類型，隨機(jī)數(shù)取至少20個(gè)個(gè)體單獨(dú)進(jìn)行分析。（二） DNA提取CTAB提取法：幼苗或葉片約200-300mg，置于2.0mL離心管，加液氮充分研磨，或取種子充分磨碎，移入2.0mL離心管;每管加入700pL65°C預(yù)熱的CTAB提取液后，充分混合，65C保溫60min，期間多次顛倒混勻；每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇混合液，充分混合后，靜置10min；12,000rpm離心15min后，吸取上清液至一新離心管，再加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒離心管數(shù)次，在-20C放置30min；4C，12,000rpm離心10min，棄上清液；加入70%乙醇，旋轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，棄去乙醇；將離心管倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺上，室溫干燥沉淀6h以上；加入100pL超純水或TE緩沖液，充分溶解后備用。2.SDS提取法：剝?nèi)∈N子的胚，放入1.5mL離心管中，加入100pl氯仿后研磨，加入300plSDA提取液，混勻后于10,000rpm離心2min，吸上清液加入預(yù)先裝有300pl異丙醇和300plNaCl溶液的1.5mL離心管中，待DNA成團(tuán)后挑出，經(jīng)70%乙醇洗滌后加入200plTE緩沖液，待充分溶解后備用。試劑盒提取法：使用經(jīng)驗(yàn)證適合SSR指紋技術(shù)的商業(yè)試劑盒，按照試劑盒的使用說明操作。注：以上為推薦的DNA提取方法，其它達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法均適用。（三） PCR擴(kuò)增引物選擇首先選擇表附-4中前20對引物進(jìn)行檢測，當(dāng)樣品間檢測出的差異位點(diǎn)數(shù)小于2時(shí)，再選用表附-4中后20對引物進(jìn)行檢測；必要時(shí)，進(jìn)一步選擇特定標(biāo)記進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系各組分的終濃度如下：每種dNTP0,J0mmol/L，正向、反向引物各0.24pmol/L，TaqDNA聚合酶0.04U/rl，1XPCR緩沖液（含Mg2+2.5mmol/L），DNA溶液2.5ng/pl，其余以超純水補(bǔ)足至所需體積。如果PCR過程中不采用熱蓋程序，則反應(yīng)液上加蓋15mL礦物油，以防止反應(yīng)過程中水分蒸發(fā)。反應(yīng)程序94C預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94C變性40s，60C退火35s，72C延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72C延伸10min，4C保存。（四）PCR產(chǎn)物檢測普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)清洗玻璃板用清水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95%乙醇擦洗兩遍，干燥。在長板上涂上0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。組裝電泳版待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。灌膠在100mL4.5%PAGE膠中加入TEMED和25%過硫酸銨各1001，迅速混勻后灌膠。待膠流動到下部，在上部輕輕的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌膠時(shí)應(yīng)勻速以防止出現(xiàn)氣泡。預(yù)電泳在正極槽(下槽)中加入1XTBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65°C的1XTBE緩沖液600mL，拔出梳子。90W恒功率預(yù)電泳10-20mino變性在20r1PCR產(chǎn)物中加入4以6X加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序：95C變性5min，4°。冷卻10min以上。電泳用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳子。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5以樣品。80W恒功率電泳全上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會緊貼在長板上。注：預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在150bp以下時(shí)電泳時(shí)間應(yīng)適當(dāng)縮短，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在300bp以上時(shí)電泳時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長。銀染固定：固定液中輕輕晃動3min；漂洗：雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s；染色：染色液中染色5min；漂洗：雙蒸水快速漂洗，時(shí)間不超過10s；顯影：顯影液中輕輕晃動至帶紋出現(xiàn)；定影：固定液中定影5min；漂洗：雙蒸水漂洗1min。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳樣品制備等體積混合不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1叫加入到DNA分析儀專用96孔板孔中。板中各孔分別加入0.1叫分子量內(nèi)標(biāo)和8.9叫去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95C變性5min，取出，立即置于碎冰上，冷卻10min以上。離心10s后置放到DNA分析儀上。電泳檢測按照儀器操作手冊，編輯樣品表，執(zhí)行運(yùn)行程，保存數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)記錄對普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的等位變異與參照品種的等位變異片段大小進(jìn)行比較，確定樣品在該位點(diǎn)的等位變異；對熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳，通過參照品種消除同型號不同批次間或不同型號DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取樣品在該位點(diǎn)的等位變異。純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上兩個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1：樣品在某個(gè)位點(diǎn)上僅出現(xiàn)一個(gè)等位變異，為150，在該位點(diǎn)的基因型記錄為150/150；示例2：樣品在某個(gè)位點(diǎn)上有兩個(gè)等位變異，分別為150、160，在該位點(diǎn)的基因型記錄為150/160。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)當(dāng)對送驗(yàn)樣品混合DNA進(jìn)行分析時(shí)，可直接進(jìn)行品種間成對比較，如果樣品某個(gè)引物位點(diǎn)出現(xiàn)可見的異質(zhì)性且影響到差異位點(diǎn)判定時(shí)，可重新提取至少20個(gè)個(gè)體的DNA，并用該引物重新擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)在該引物位點(diǎn)上不同個(gè)體的基因型（或等位變異）及所占比例。當(dāng)對送檢樣品多個(gè)個(gè)體DNA進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)統(tǒng)計(jì)其在各引物位點(diǎn)的各種基因型（或等位變異）及所占比例。對單交種，應(yīng)比較兩個(gè)樣品在各引物位點(diǎn)的基因型；對自交系，應(yīng)比較兩個(gè)樣品在各引物位點(diǎn)的等位變異。成對比較的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)記錄表見表附-3。（六）判定規(guī)則結(jié)果判定當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)N2，判定為“不同”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“近似”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為“極近似或相同”。對利用附錄C中40對引物仍未檢測到N2個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，如果相關(guān)品種存在特定標(biāo)記，必要時(shí)增加其特定標(biāo)記進(jìn)行檢測。結(jié)果表述比較位點(diǎn)數(shù)：，比較位點(diǎn)為：；差異位點(diǎn)數(shù)：，差異位點(diǎn)為：；判定為：。表附-3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)記錄表樣品1編號、名稱及來源：樣品2編號、名稱及來源：編號引物名稱指紋數(shù)據(jù)是否存在差異備注樣品1樣品2P01bnlg439w1P02umc1335y5P03umc2007y4P04bnlg1940k7P05umc2105k3P06phi053k2

P07phi072k4P08bnlg2291k4P09umc1705w1P10bnlg2305k4P11bnlg161k8P12bnlg1702k1P13umc1545y2P14umc1125y3P15bnlg240k1P16phi080k15P17phi065k9P18umc1492y13P19umc1432y6表附-3（續(xù)）編號引物名稱指紋數(shù)據(jù)是否存在差異備注樣品1樣品2P20umc1506k12P21umc1147y4P22bnlg1671y17P23phi96100y1P24umc1536k9P25bnlg1520K1P26umc1489y3P27bnlg490y4P28umc1999y3P29umc2115k3P30umc1429y7P31bnlg249k2P32phi299852y2P33umc2160k3P34umc1936k4

P35bnlg2235y5P36phi233376y1P37umc2084w2P38umc1231k4P39phi041y6P40umc2163w3比較位點(diǎn)數(shù)： ，差異位點(diǎn)數(shù)： 。注1:是否存在差異欄可填寫是、否、無法判定、缺失。當(dāng)樣品在某個(gè)引物位點(diǎn)出現(xiàn)可見的異質(zhì)性且影響到差異位點(diǎn)判定時(shí)，可填寫無法判定，或重新提取至少20個(gè)個(gè)體的DNA，并用該引物重新擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)在該引物位點(diǎn)上不同個(gè)體的基因型（或等位變異）及所占比例后予以判定。注2：如果采用了備案的其它特征標(biāo)記進(jìn)行鑒定，可在記錄表中依次添加。注3：當(dāng)以兩個(gè)自交系樣品的組合作為待測樣品時(shí)，指紋數(shù)據(jù)欄應(yīng)填寫兩個(gè)自交系的指紋組合作為待測樣品指紋。表附-440對核心引物名單及序列編號引物名稱染色體位置引物序列P01bnlg439w11.03上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCP02umc1335y51.06上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGP03umc2007y42.04上游：TTACACAACGCAACACGAGGC下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACP04bnlg1940k72.08上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCP05umc2105k33.00上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGP06phi053k23.05上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCP07phi072k44.01上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTCP08bnlg2291k44.06上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCP09umc1705w15.03上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGP10bnlg2305k45.07上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGP11bnlg161k86.00上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCP12bnlg1702k16.05上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC下游：AGGACACGCCATCGTCATCAP13umc1545y27.00上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTP14umc1125y37.04上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC下游：CCACCAACCCATACCCATACCAGP15bnlg240k18.06上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACP16phi080k158.08上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC

P17phi065k99.03上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCP18umc1492y139.04上游：GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGP19umc1432y610.02上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCP20umc1506k1210.05上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACAC表附-4（續(xù)）編號引物名稱染色體位置引物序列P21umc1147y41.07上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCP22bnlg1671y171.10上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATGP23phi96100y12.00上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCP24umc1536k92.07上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCG下游：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGCP25bnlg1520K12.09上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGP26umc1489y33.07上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTP27bnlg490y44.04上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTAP28umc1999y34.09上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCGP29umc2115k35.02上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGP30umc1429y75.03上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGP31bnlg249k26.01上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGP32phi299852y26.07上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTP33umc2160k37.01上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTP34umc1936k47.03上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCP35bnlg2235y58.02上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTP36phi233376y18.09上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCP37umc2084w29.01上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCP38umc1231k49.05上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCP39phi041y610.00上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACP40umc2163w310.04上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGC五、作業(yè)比較并分析實(shí)驗(yàn)小組間或重復(fù)間產(chǎn)生誤差的原因。分析SSR分析的關(guān)鍵技術(shù)，評價(jià)SSR技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。討論單個(gè)SSR標(biāo)記檢測結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)六種子水分測定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握種子水分測定的基本原理和方法，了解電烘箱的的構(gòu)造、原理和使用方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具1.材料水稻、棉花、大豆、小麥、玉米、花生等作物種子。用具恒溫烘箱、感量0.001g天平、粉碎機(jī)、樣品盒、干燥器、干燥劑、坩鍋鉗、角匙等。三、 實(shí)驗(yàn)的方法步驟（一） 高恒溫烘干法把恒溫烘箱溫度調(diào)節(jié)到140?145°C°C預(yù)熱。把樣品盒預(yù)先烘干、冷卻、稱重，并記下盒號。從送驗(yàn)樣品中取15?25g種子，水稻、小麥、玉米進(jìn)行磨碎（細(xì)度全少50%通過0.5mm篩孔的金屬絲篩，而留在1.0mm篩子上不超過10%），大豆粗磨，棉花和花生種子磨碎或切成薄片。稱取試樣2份，每份4.5?5.0g，放入樣品盒。將樣品盒放入烘箱內(nèi)，在5?10min內(nèi)，當(dāng)溫度回升到130C?133C時(shí)，開始計(jì)算時(shí)間。在130C?133C下烘1h，打開箱門，蓋好盒蓋，放入干燥器內(nèi)冷卻30?45min后再稱重。（二） 結(jié)果計(jì)算種子水分（％）='^m2~~m^x1002 1式中：M1一樣品盒和蓋的重量；M2一樣品盒和蓋及樣品的烘前重量；M3-樣品盒和蓋及樣品的烘后重量。若用預(yù)先烘干法，可從第一次（預(yù)先烘干）和第二次按上述公式計(jì)算所得的水分結(jié)果換算樣品的原始水分。即:

種子水分(%)=S+S-S]x七1 2 100式中：S]—第一次整粒種子烘后失去的水分;S2—第二次磨碎種子烘后失去的水分。測定數(shù)值填入表附-5表附-5種子水分測定記載表作物名稱烘干步驟測定方法盒號盒重(g)試樣重(g)(盒』重卜樣)(g)失重(g)水分(%)重復(fù)間差異(％)水分(%)水分(%)烘刖烘后檢測依據(jù)GB/T3543.6—1995說明：1、環(huán)境條件：溫度 ，相對濕度 %;2、烘干步驟一欄用于填寫高水分預(yù)先烘干法的兩次烘干。檢驗(yàn)員： 日期：校核人：日期：審核人：日期:實(shí)驗(yàn)七電導(dǎo)率法測定種子活力一、實(shí)驗(yàn)的目的與要求通過本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生了解電導(dǎo)率法測定種子活力的原理，掌握電導(dǎo)率法測定種子活力的方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具材料不同活力的豌豆、大豆等種子器具電導(dǎo)儀、天平、濾紙、尼龍絲網(wǎng)或塑料絲網(wǎng)、燒杯、鑷子等。三、 實(shí)驗(yàn)的方法步驟從不同活力的大豆種子中數(shù)取試樣50粒，2次重復(fù)。將試樣稱重，精確到0.01g。將試樣放入干凈的150ml三角瓶中，加入100ml無離子水，加蓋防塵，于20°C條件下浸種24h，另用一杯無離子水作對照。用濾紙或清潔絲網(wǎng)瀝去種子。用電導(dǎo)儀測定浸種液和對照液的電導(dǎo)率。計(jì)算平均電導(dǎo)率，換算成單位重量樣品的電導(dǎo)率。四、作業(yè)計(jì)算各試樣的電導(dǎo)率，并分析不同種子批的活力差異。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握加速老化法測定種子活力的基本原理、適用范圍、操作步驟和注意事項(xiàng)。二、 實(shí)驗(yàn)材料與用具1.實(shí)驗(yàn)材料大豆種子2.用具老化外箱、老化內(nèi)箱、感量0.001g天平、去離子水或蒸餾水、帶刻度的容量杯（刻度從0至100mL）、鋁盒（供種子水分測定）、發(fā)芽試驗(yàn)設(shè)備。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 預(yù)備試驗(yàn)?檢查老化外箱老化外箱的溫度必須經(jīng)過國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量院的檢定或類似的溫度計(jì)。檢查溫度溫度要達(dá)到4l±0.3°C下才能進(jìn)行測定。保證老化內(nèi)箱的清潔度為了防止菌類污染，使用過的老化內(nèi)箱、蓋和網(wǎng)架需經(jīng)過熱消毒或用15%次氯酸鈉溶液洗凈并烘干。（二） 測定每一種子批的程序檢查種子水分如果不知道測定種子批的水分，應(yīng)