多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。2．DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。3．PCR反應(yīng)需要DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶等條件。4．PCR原理：DNA熱變性的原理。5．PCR每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性和延伸三步。6．PCR擴(kuò)增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長(zhǎng)。

[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件原料4種

模板2條DNA母鏈酶

和

引物使DNA聚合酶能夠從引物的

開始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶3′端2．PCR擴(kuò)增的原理及條件(1)PCR技術(shù)：即

，是一種

迅速擴(kuò)增

的技術(shù)。它能以極少量的

為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。(2)擴(kuò)增方向：總是從子鏈的

端向

端延伸。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外DNA片段DNA5′3′(3)引物：①特點(diǎn)：是一小段

或

，能與

的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為

個(gè)核苷酸。②需要引物的原因：DNA聚合酶不能

，而只能從

延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要引物。DNARNADNA母鏈20～30從頭合成DNA3′端DNA的熱變性DNA兩條模板鏈脫氧核苷酸耐高溫的緩沖溶液自動(dòng)調(diào)控溫度3．PCR的反應(yīng)過程(1)

：溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈

(2)

：溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合

(3)

：溫度上升到72℃左右時(shí)，在

酶的作用下，四種脫氧核苷酸通過堿基互補(bǔ)配對(duì)合成新DNA鏈變性復(fù)性延伸DNA聚合1．DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？提示：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。2．PCR擴(kuò)增DNA過程中是否還需要解旋酶？提示：不需要。3．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增1個(gè)DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脫氧核苷酸鏈所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？提示：1/2n；100%。

[跟隨名師·解疑難]1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR技術(shù))的比較細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR不同點(diǎn)解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80℃～100℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA溫度體內(nèi)溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)(先導(dǎo)鏈)，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連結(jié)(滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成相同點(diǎn)①提供DNA模板②四種脫氧核苷酸作原料③子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端2．PCR反應(yīng)過程(1)變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，如圖：(2)復(fù)性：系統(tǒng)溫度下降至50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：(3)延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖：[特別提醒]PCR反應(yīng)的結(jié)果①PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延伸三步。②兩引物之間的固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 [自讀教材·夯基礎(chǔ)]微量移液器1．實(shí)驗(yàn)操作程序準(zhǔn)備：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放于實(shí)驗(yàn)桌上移液：用

按照配方在微量離心管中依次加入各組分混合：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁

：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s。目的是

使反應(yīng)液集中在

反應(yīng)：將離心管放入

中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)離心管底部PCR儀2．DNA含量的測(cè)定(1)原理：利用DNA在

的紫外線波段的吸收峰曲線來測(cè)定相應(yīng)含量。(2)計(jì)算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)。260nm離心 [跟隨名師·解疑難]1．實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)(1)為避免外源DNA等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。(2)所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。(3)在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。所有成分都加入后，通過手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。2．結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)量，以判斷DNA片段的擴(kuò)增是否成功。具體方法如下：(1)稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋。(2)對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。(3)測(cè)定：取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。(4)計(jì)算：檢測(cè)DNA片段的擴(kuò)增情況，可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，計(jì)算公式為：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)。如果擴(kuò)增不成功，則要分析失敗原因。可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。[特別提醒]

公式中的50代表在波長(zhǎng)260nm紫外波段照射下，吸收峰為1時(shí)，DNA含量為50μg/mL。[例1]多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95℃下變性(使模板DNA解旋)→55℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72℃下延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是(

)A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的C．延伸過程中需要DNA聚合酶和四種核糖核苷酸D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高[解析]變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開，體內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來實(shí)現(xiàn)；借助堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物可與DNA模板鏈結(jié)合；延伸時(shí)是形成新的DNA分子，需要以脫氧核苷酸為原料；PCR過程的溫度高，會(huì)導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫DNA聚合酶。[答案]

C(1)DNA母鏈的3′端對(duì)應(yīng)著子鏈的5′端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?2)解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的。(3)DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。[例2]在遺傳病及刑偵破案中常需要對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題：a鏈5′－G－G……T－C－3′

5′－G－G－OH(引物Ⅰ)

b鏈3′－C－C……A－G－5′(引物Ⅱ)

95℃5′－G－G……T－C－3′

3′－C－C……A－G－5′

55℃5′－G－G……T－C－3′

3′－C－C……A－G－5′

72℃5′－G－G－OH

________________

________________(1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ，并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。(2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。(3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，請(qǐng)分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn)是________；循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________。[解析]

(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，引物就提供了3′端。子鏈延伸方向?yàn)?′→3′，引物Ⅰ與b鏈部分堿基互補(bǔ)，引物Ⅱ則與a鏈部分堿基互補(bǔ)，且連接到a鏈的3′端，故引物Ⅱ的結(jié)構(gòu)為5′－G－A－OH，復(fù)性結(jié)果為：

HO－A－G－5′5′－G－G……T－C－3′。(2)經(jīng)過一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA分子分別含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作為原料的四種脫氧核苷酸被32P標(biāo)記，所以新合成的子鏈均含有放射性，一次循環(huán)后的兩個(gè)DNA各有一條鏈含32P，若復(fù)制n次，產(chǎn)生子鏈共2n×2，其中只有親本的兩條母鏈不含32P，則其所占比例為2/(2n·2)＝1/2n。[答案]

(1)5′－G－A－OH

a鏈5′－G－G……T－C－3′

HO－A－G－5′(2)5′