LC-MS/MS臨床檢驗應(yīng)用進展上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院李水軍2013.10.29報告提綱液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)原理國內(nèi)外臨床應(yīng)用進展在我院的應(yīng)用情況介紹同型半胱氨酸25-羥基維生素D1,5-脫水葡萄糖醇問題和展望質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展歷史1906Joseph

John測定電子荷質(zhì)比1922FrancisWilliam發(fā)現(xiàn)同位素1989WolfgamgPaul發(fā)明離子阱2002JohnFenn發(fā)明電噴霧離子化質(zhì)譜儀組成由離子源、真空接口、質(zhì)量分析器和檢測器組成。根據(jù)檢測器類型可分為磁質(zhì)譜、四級桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、傅里葉回旋共振質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜。產(chǎn)生帶電離子離子源真空接口質(zhì)量分析器檢測器引入帶電離子按m/z分離和排列電信號放大樣品引入數(shù)據(jù)分析LC-MS/MS儀靈敏度μg/mL靈敏度ng/mL或者pg/mLHPLC,$$MS,$$$APIHighvacuumLC-MS/MS工作原理+Ionization+++MS1+MS2FragmentationDetectionLCLC-MS/MS優(yōu)勢特異性好，免疫分析對小分子化合物的檢測缺陷比HPLC和GC-MS的容易使用，通量更大，是免疫分析法的主要互補方法與其他技術(shù)相比，單個樣本的測試成本更低建立和驗證新方法比較容易國外LC-MS/MS應(yīng)用2000年，LC-MS/MS開始應(yīng)用于藥物研發(fā)領(lǐng)域，逐步從標準技術(shù)成為國際通用技術(shù)2010年，LC-MS/MS廣泛應(yīng)用于歐美臨檢參考實驗室。由于第三方檢測機構(gòu)的推動，

從大型醫(yī)院臨檢實驗室向中小型、甚至社區(qū)醫(yī)院擴展Vogeser,ClinChemLabMed2003;41:117-126.Dooley,ClinBiochem2003;36:471-481.Vogeser,ClinBiochem2008;41:649-662.LC-MS在PubMed論文發(fā)表數(shù)量臨檢主要應(yīng)用領(lǐng)域新生兒篩查：氨基酸、肉毒堿、脂肪酸、有機酸藥物中毒、濫用藥物分析、止痛藥物分析治療藥物監(jiān)測：免疫抑制劑、抗癲癇藥物、抗心律失常藥內(nèi)分泌分析：腎上腺激素、性激素蛋白鑒定和定量：C肽、PTH、血管緊張素功能醫(yī)學檢測以美國Mayo

Clinic為例，1998年沒有LC-MS/MS。2010年，60臺LC-MS/MS，200萬個測試。GrebeSK,SinghRJ.ClinBiochemRev.2011Feb;32(1):5-31.LC-MS/MS國內(nèi)應(yīng)用現(xiàn)狀在各大醫(yī)院已普及，主要用于臨床藥理但在臨檢領(lǐng)域尚處于起步階段衛(wèi)生部臨檢中心部分醫(yī)院檢驗科第三方檢驗機構(gòu)質(zhì)譜法常作為參考方法，用于參考測量程序和校準品定值我院應(yīng)用簡介2000年引進LC-MS/MS，主要用于臨床藥理和臨床科研。2002年開始探索臨檢應(yīng)用：同型半胱氨酸、TDM、生物標志物（心血管病、糖尿病、前列腺癌）、內(nèi)分泌（性激素、腎上腺激素）、維生素、氨基酸等。同型半胱氨酸(Hcy)：

心血管疾病獨立危險因子H型高血壓增加心腦血管事件30倍051015202530ReferenceCholesterolSmokingHypertensionNoElevatedFastingHomocysteineElevatedFastingHomocysteineRiskFactorsRelativeRisk(Vascular

Disease)流行病學研究證明，“H型”高血壓患者心血管事件發(fā)生率較單純存在高血壓的患者高出約5倍，較正常人高出約25-30倍。GrahamIM,etal.JAMA.1997;277(22):1775-81.Hcy代謝HcyMetAdoMetAdoHcyTHFCH3THFCH2THFCHOTHFCysB6BHMTMTRB12B2蛋氨酸循環(huán)葉酸循環(huán)RefsumH,etal.ClinChem.2004;50(1):3-32.血中Hcy形式Hcy-AlbuminHcy-CysHcy80%bHcy20%fHcy正常tHcy5-15μmol/LHcy檢測方法原理檢測分析流程臨床研究與應(yīng)用體檢人群血漿/血清Hcy測定結(jié)果組別例數(shù)年齡Hcy（μmol/L）P值*正常對照組2039.9±9.913.1±3.4

心腦血管病高危人群14945.0±7.920.2±12.7＜0.01糖尿病2447.2±5.921.3±12.3＜0.01住院病人血漿/血清Hcy測定結(jié)果組別例數(shù)年齡Hcy（μmol/L）P值*對照組3869.2±12.313.9±6.6

腦梗塞4075.0±9.422.0±14.9＜0.01冠心病4579.3±5.818.3±7.9＜0.05高血壓4871.1±10.316.8±7.8＜0.05LiS,etal.JChromatogrB.2008;870(1):63-67衛(wèi)生部臨床檢驗中心

2011年全國同型半胱氨酸EQA循環(huán)酶法和LC-MS/MS法結(jié)果差異明顯，Bias從10.64%至21.80%循環(huán)酶法的室間差異較大，CV9.10-12.61%。合作開發(fā)檢測試劑盒國內(nèi)首個獲得SFDA批準，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜HCY體外診斷試劑盒[國食藥監(jiān)械（準）字2007第3401206號]與現(xiàn)有方法比較優(yōu)勢LC-MS/MS技術(shù)已成為目前生物樣品中小分子化合物定性定量測定的金標準方法高準確性和特異性，直接測定質(zhì)量,專一、靈敏、通用高通量：超過400測試/天長期運行成本低：使用通用試劑、消耗品成本低廉，大批量測定有優(yōu)勢25羥基維生素D(25OHD)：

維生素D營養(yǎng)狀況的最佳指標VITAMIND據(jù)估計，全球有10億人維生素D缺乏或者不足。骨質(zhì)疏松癥只是維生素D缺乏的冰山一角，對人體的健康的影響極為廣泛。維生素D可降低慢性病，包括癌癥、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病等發(fā)病風險?！?0ng/mL缺乏21-29ng/mL不足30-60ng/mL充足25OHD水平維生素D營養(yǎng)狀態(tài)維生素D缺乏相當普遍HolickMF.NEnglJMed.2007;357(3):266-281.上海的維生素D調(diào)查情況25OHD濃度維生素D狀況比例<10ng/mL嚴重缺乏（15）8%10-20ng/mL缺乏（141）73%20-30ng/mL不足（33）17%30-60ng/mL充足（4）2%>150ng/mL中毒（0）0%25OHD16.4±5.3ng/mL(2.5th-97.5th7.9-28.8ng/mL)25OHD檢測市場需求巨大25OHD檢測方法比較免疫法通常只能測總25OHD體內(nèi)類似物多，交叉反應(yīng)大，影響結(jié)果準確性HPLC法測定費時，工作量大靈敏度可能不足LC-MS/MS可分別測定25OHD2和25OHD3，有助于臨床療效判斷靈敏度、特異性較好LC-MS/MS與ECLIA方法比較y=0.514x+1.269ng/mL,r=0.590,Sy|x=-11.9ng/mL(ECLIAfor25OHD3)LC-MS/MS與ECLIA總25OHD比較y=1.364x-1.815ng/mL,r=0.834,Sy|x=5.22ng/mL(ECLIAfor25OHDtotal)LC-MS/MS與EIA總25OHD比較y=1.120x+7.274ng/mL,r=0.723,Sy|x=9.06ng/mL(EIAfor25OHDtotal)y=0.885x+1.672ng/mL,r=0.987,Sy|x=-1.88ng/mL(LC-MS/MSfor25OHD2and25OHD3)LC-MS/MS與美國CAP比較LC-MS/MS與NIST的LC-MS/MS參考方法比較y=0.9222x-0.045ng/mL,r=0.9971,Sy|x=1.47ng/mL(LC-MS/MSfor25OHD2and25OHD3)方法不同導致完全不同的臨床判斷1,5-脫水葡萄糖醇

(1,5-AG)我國糖尿病現(xiàn)狀36控制糖尿病并發(fā)癥風險糖尿病的并發(fā)癥分為微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥。中華醫(yī)學會糖尿病學分會慢性并發(fā)癥調(diào)查組報告住院2型糖尿病并發(fā)癥患病率分別為：高血壓34.2%，腦血管病12.6%，心血管病17.1%，下肢血管病5.2%。防治心腦血管疾病所需的醫(yī)療支出，占糖尿病醫(yī)療費用的最主要部分。單純餐后血糖升高者占近50%。37中國2型糖尿病防治指南（2010版）血糖控制不良人群占63%DatafromNHANESandDCCT血糖監(jiān)測指標1,5AG果糖胺108975643120HbA1C葡萄糖Weeksbefore

measurement1,5-AG使血糖監(jiān)控更加嚴密完整和科學！1,5-AG的生理特征40組織庫存(500-1000mg)腎飲食攝入1,5-AG(5-10mg/天)尿排泄1,5-AG(5-10mg/天)

BuseJBetal.DiabTech&Ther2003,5(3):355-363高血糖尿排泄1,5-AG增加1,5-AG重吸收血1,5-AG下降1,5-AG可監(jiān)測到血糖的細微變化YamanouchiTetal.Lancet19962型糖尿病人治療過程中考察1，5-AG的變化A組28例糖尿病人連續(xù)治療6周B組28例糖尿病人連續(xù)治療4周后終止治療方法驗證臨床應(yīng)用

LiSetal.JChromatogr.2008;875(2):459-64.1,5-AG與其他指標的相關(guān)性1,5-AG臨床意義11,5-AG是短期血糖控制和血糖波動的監(jiān)測指標，反映3天-1周的血糖水平。2快速敏感地響應(yīng)血糖變化，適用于嚴格血糖控制監(jiān)測，可作為診斷糖尿病情好轉(zhuǎn)與惡化趨勢的敏銳指標。31,5-AG能更特異性且有效地反映餐后血糖，即使在HbA1C水平相同者也截然不同，因此測定1,5-AG有利于監(jiān)控糖尿病并發(fā)癥的風險。41,5-AG水平不受輕度或中度腎功能不全的影響，對輕度或中度腎功能不全的2型糖尿病患者，1,5-AG仍可作為血糖控制的可靠指標。1,5-AG與血糖控制關(guān)系1,5-AG(μg/mL)血糖控制情況>14.0正常10–13.9控制良好6–9.9控制一般2–5.9控制差<2控制非常差美國糖尿病協(xié)會指出預防糖尿病病并發(fā)癥的重要性在于嚴格的血糖控制。間歇性的血糖波動比慢性高血糖對血管內(nèi)皮細胞的損傷更大。1,5-AG測試結(jié)果2周內(nèi)發(fā)生變化，醫(yī)生可以利用檢測結(jié)果及時了解患者血糖控制的改進效果或惡化程度。1,5-AG能更準確地反映餐后血糖變化情況，有利于監(jiān)控糖尿病并發(fā)癥的風險。優(yōu)勢和潛力國際認可、國內(nèi)尚未普及的臨檢新指標

金標準方法，臨床診斷的準確性優(yōu)勢明顯高通量檢測，連續(xù)測試可超過300個/天有效填補臨床糖尿病管理的信息數(shù)據(jù)鏈缺口

可客觀評價病人住院期間的血糖控制情況其臨床應(yīng)用推廣及相關(guān)科研價值凸顯質(zhì)譜技術(shù)用于臨床問題與瓶頸技術(shù)操作政策技術(shù)方法重現(xiàn)性通量限制分析時間樣品處理和信息系統(tǒng)的連接內(nèi)源性物質(zhì)、同分異構(gòu)體、代謝物的干擾基質(zhì)效應(yīng)（離子抑制／增強）穩(wěn)定同位素內(nèi)標（ID-MS）Vogeser,Cl