索取號(hào)：密級(jí)：加密tRNA(transferribonucleicacid)3，端加工成熟過(guò)程，是指剪切掉tRNA前體3’端的多余堿基序列以及在其末端添加CCA的過(guò)程。只有加工成熟后的并帶有3，CCA末端的tRNA才能進(jìn)行氨基?；瑘?zhí)行其在蛋白合成過(guò)程中的功能。真核生物、古生菌和一些細(xì)菌的tRNA基因不編碼3,末端CCA，其CCA需要在tRNA3,末端加工成熟后再添加上去，這類(lèi)tRNA的3,末端的加工成熟需要核酸內(nèi)切酶tRNaseZ參與。粟酒裂殖酵母Schizosaccharomycespombe中含有兩種tRNaseZ基因:sptrz1+(SPAC1D4.10)和sptrz2+(SPBC3D6.03c)，它們編碼的蛋白分別定位于細(xì)胞核和線粒體中。本實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)證實(shí)兩種tRNaseZ都是必需基因。我們已經(jīng)完成了對(duì)sptrz1+的功能的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容是得到一株sptrz2+的溫度敏感型突變菌株，并利用該菌株進(jìn)行SpTrz2p功能的相關(guān)研究。在我們實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中,冷泉港實(shí)驗(yàn)室DanielleV.報(bào)道sptrz2-A623V的突變會(huì)使菌株產(chǎn)生溫度敏感的表型。本實(shí)驗(yàn)中，我們把sptrz2-A623V突變引入到遺傳背景比較清楚的菌株S.pombeyAS56中的，得到具有溫度敏感型的菌株tsD。根據(jù)對(duì)tsD中sptrz2-A623V的基因型進(jìn)行測(cè)序鑒定以及帶有sptrz2+的外源質(zhì)粒限制性溫度下救活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們確認(rèn)tsD即為sptrz2+的溫度敏感型菌株，可以用于對(duì)SpTrz2p相關(guān)功能的進(jìn)一步研究。我們也對(duì)溫敏菌株sptrz2+加標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)，選擇了三種標(biāo)簽：HA、3HA、GFP，從而可以利用western技術(shù)跟蹤細(xì)胞內(nèi)SpTrrz2蛋白的表達(dá)量。得出溫度敏感型菌株產(chǎn)生的原因，但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽對(duì)Sptrz2p蛋白功能有影響：HA、3HA對(duì)蛋白功能的影響較GFP嚴(yán)重。我們成功的給野生型s.pombeYas56加上了GFP標(biāo)簽，但無(wú)法給溫度敏感型菌株加上標(biāo)簽，我們進(jìn)而采用重組蛋白的方法制備Sptrz2p的抗體。關(guān)鍵詞：S.pombe，tRNaseZ，溫敏菌株，GFPAbstracttRNA3'-endmaturationisaprocessthroughwhichthe3'-trailersequenceofprecursortRNAs(pre-tRNAs)isremoved,andprocessedtRNAsacquiretheCCAendwhichisabsolutelyessentialfortRNAaminoacylationandproteinsynthesis.Asforeukaryotes,archaeaandsomebacteria,the3'-CCAsequenceisnotgenomicallyencoded.The3'-trailersequenceofpre-tRNAsisremovedbytRNaseZandthe3'-CCAtailisaddedpost-transcriptionally.InSchizosaccharomycespombethereexiststwotRNaseZgenes,designatedsptrz1+(SPAC1D4.10)andsptrz2+(SPBC3D6.03c),encodingthenuclearandmitochondrialtRNaseZs,respectively.Inourpreviousstudy,wehavedemonstratedthatbothofthetwotRNaseZsinSchizosaccharomycespombeareessential.Wehavecarriedoutstudiesonsptrz1+anddrawedsomedefiniteconclusions.Inthisstudy,weintentedtoobtainatsstrainofsptrz2+andcarriedoutstudiesonthefunctionofit.Duringourresearchwork,welearnedaboutthatthesptrz2-A623Vmutationinducedtemperature-sensitivephenotypetothestrainDI13,whichwasdiscoveredbytheDirvinefromColdSpringHarborInstitute.WeaskedDirvinefortheplasmidwithtrz2-A623V.OthermembersinourlaborataryinsertedthekanMX6geneintothevectortoconstructthetargetingvectorpBSIIK-sptrz2-kanMX6.Thenweintroducedthetrz2-A623VmutationintoS.pombeyAS56andobtainedourtsstraintsD.Afteraseriesoftestingexperiments,suchasphenotypeverification,genotypeverificationandcomplementationofthetemperature-sensitivitybysptr2+,wedrawedtheconclusionthattsDwastheverytsmutationstrainthatcouldbeusedforfurtherfuctionalcomplementationstudyonsptrz2+.Keywords:S.pombe,tRNaseZ,tsstrain,high-copysuppressorgene第1章綜述tRNA（transferribonucleicacid）是攜帶并轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸到核糖體上，在mRNA指導(dǎo)下合成蛋白質(zhì)的一類(lèi)小分子核糖核酸。tRNA的研究是分子生物學(xué)中一個(gè)重要而且活躍的研究領(lǐng)域。在所有的真核生物體、古生菌和一些細(xì)菌體內(nèi)，tRNA分子先轉(zhuǎn)錄形成前體，經(jīng)過(guò)一系列的加工后成為具有功能的成熟tRNA分子。這些加工步驟包括去除5'前導(dǎo)序列、3'末端序列、切除內(nèi)含子、進(jìn)行堿基修飾等23］、添加末端CCA（主要在真核生物中）如圖1.1）。目前tRNA分子5'端加工機(jī)制已研究得比較清楚，而其3'末端的加工還在進(jìn)一步研究中。tRNaseZ（transferRNA（tRNA）3'processingendoribonuclease）是--種催化tRNA前體3'末端加工成熟的核酸內(nèi)切酶。tRNA3'末端的加工在1979年就已發(fā)現(xiàn)囹，但相應(yīng)的內(nèi)切酶及基因序列直到2002年才被發(fā)現(xiàn)⑵。這種蛋白最早是從小麥中純化出來(lái)的，根據(jù)其序列在三界（細(xì)菌、古生菌、真核生物）中鑒定出了眾多的同源物⑸。這種新的酶被命名為tRNaseZ。tRNA前體3'末端的加工tRNA前體3'末端的加工途徑取決于tRNA前體3'末端是否含有CCA序列［6-10］。已知在所有的生物中，只有3'末端帶有CCA序列的tRNA才能在tRNA-氨酰合成酶作用下氨基?；?，并行使其功能。1.1.1原核生物tRNA前體3'末端的加工在原核生物體中，有些tRNA基因編碼末端CCA序列，而有些則不編碼末端CCA序列。末端含有CCA序列的tRNA前體其3'末端CCA下游序列主要由核酸外切酶剪切，而末端不含有CCA序列的tRNA前體的3'末端則由核酸內(nèi)切酶tRNaseZ加工完成產(chǎn)生此過(guò)程，然后才能在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下正確添加CCA序列。目前對(duì)大腸桿菌Escherichiacoli和枯草芽孢桿菌BacillussubtilistRNA前體3'末端的加工研究最為透徹［9］［11-12］。Escherichiacoli所有的tRNA基因都編碼末端CCA序列，這些tRNA前體3'末端的成熟主要由核酸外切酶RNaseT和RNasePH加工完成［9,12］。RnaseD,RNaseBN和RNaseII等核酸外切酶也可參與切除3'末端序列，其活力比較低［12］，但也有內(nèi)切酶參與到其中（圖1.2B）O在Bacillussubtilis中，約有三分之二的tRNA基因編碼末端CCA序列，含有末端CCA序列的tRNA前體3'末端的加工類(lèi)似于E.coli中的tRNA前體3'末端的加工，而不含有末端CCA序列的tRNA前體3'末端的加工則是由核酸內(nèi)切酶tRNaseZ完成。tRNaseZ能在“區(qū)別堿基”（discriminatornucleotide，位于CCA5'的未配對(duì)核苷酸）后精確切割tRNA前體3'末端序列。CCA是tRNaseZ內(nèi)切酶活性的強(qiáng)抑制子，可以防止CCA被反復(fù)合成和切除［8,13］。但有一種特殊的細(xì)菌海棲熱袍菌Thermotogamaritima中tRNaseZ可以切除到CCA的3'端，T.maritima有46個(gè)tRNA基因，其中有45個(gè)編碼CCA序列，這45個(gè)tRNA前體3'端加工時(shí)由TmaTrz在CCA的3'端進(jìn)行剪切，將CCA留在tRNA3'端（圖1.2B）；一個(gè)不編碼CCA序列的是tRNAMet，由TmaTrz在“區(qū)別堿基”后進(jìn)行切割。TmaTrz將CCAmotif作為了切割的指導(dǎo)序列而不是被其抑制叫。在古生菌（archaea）中，絕大多數(shù)tRNA基因不編碼末端CCA序列，tRNA前體3'末端的加工由核酸內(nèi)切酶tRNaseZ完成⑸。1.1.2真核生物tRNA前體3'末端的加工相對(duì)于原核生物體，我們對(duì)真核生物體中的tRNA前體3'末端加工機(jī)制的研究尚處在初步階段。已知在所有的生物中，只有3'末端帶有CCA序列的tRNA才能在tRNA-氨酰合成酶作用下氨基?；?。tRNA前體的3'末端必需經(jīng)tRNaseZ加工，產(chǎn)生一個(gè)正確的3'末端后，才能在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下添加CCA。真核生物體中的tRNA基因不編碼末端CCA序列，tRNA前體3'末端的加工主要通過(guò)核酸內(nèi)切酶tRNaseZ完成。耶魯大學(xué)的Wolin實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomycespombe中，當(dāng)酵母La蛋白存在條件下，tRNA前體3'末端的加工通常由核酸內(nèi)切酶完成。在缺乏酵母La蛋白時(shí)，tRNA前體3'末端序列由未知核酸外切酶切除［15-18］。圖1.1不編碼CCA序列的tRNA前體的加工（摘自甘旭華博士論文）tRNA前體含有5'端和3'端多余序列以及內(nèi)含子，需要去除這些序列才能產(chǎn)生有功能的成熟tRNA。其5'端引導(dǎo)序列由核酸外切酶PNaseP去除，核酸內(nèi)切酶tRNaseZ去除3'端多余序列，產(chǎn)生3'端為羥基的tRNA前體，再由tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶添加CCA。許多真核生物和古細(xì)菌tRNAS因有內(nèi)含子，需要由剪接內(nèi)切酶去除，有些核苷酸還需要特殊的修飾。圖中，D表示區(qū)別堿基核苷酸，位于CCA序列的5端［⑶圖1.2含有CCA序列的tRNA前體的加工(摘自甘旭華博士論文)許多細(xì)菌、部分古生菌的tRNA基因編碼CCA序列，A.大腸桿菌中的所有tRNA基因都編碼CCA，其tRNA前體長(zhǎng)長(zhǎng)的3'末端多余序列先由核酸內(nèi)切酶RNaseZ剪切，之后再由核酸外切酶RNaseT和RNasePH剪切。B.海棲熱袍菌中，含有CCA序列的tRNA前體由tRNaseZ在CCA的3'端進(jìn)行剪切，將CCA留在tRNA3'端，產(chǎn)生的tRNA可以被氨基?；?。D代表位于CCA序列5'端的區(qū)別堿基核苷酸［13］。tRNaseZ的結(jié)構(gòu)與功能研究1.2.1tRNaseZ的兩種類(lèi)型tRNaseZ存在于細(xì)菌、古生菌及真核生物中，有兩種類(lèi)型，長(zhǎng)型(tRNaseZl)含有648-1174個(gè)氨基酸殘基，只存在于真核生物中；短型(tRNaseZS)含有395-554氨基酸殘基，廣泛存在于上述三界生物中⑵。三界生物中所含有的tRNaseZ的類(lèi)型和數(shù)目是不一樣的。一般來(lái)說(shuō)，真核生物至少含有一種tRNaseZL，例如線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和釀酒酵母S.cerevisiae都只含有一種tRNaseZl,不含有短型tRNaseZS；人有一種tRNaseZS(HsaTrz1/ELAC1)和一種tRNaseZl(HsaTrz2/ELAC2)［19］；粟酒裂殖酵母S.pombe有兩種tRNaseZL；擬南芥A.thaliana有兩種tRNaseZL和兩種tRNaseZS。目前還不清楚為什么不同的生物中存在著不同種類(lèi)和不同數(shù)目的tRNaseZ。tRNaseZl可在細(xì)胞核和線粒體內(nèi)都有分布。目前預(yù)測(cè)出許多tRNaseZl在N-端有細(xì)胞核定位序列或線粒體定位序列，而tRNaseZs缺少這些結(jié)構(gòu)域，所以推測(cè)tRNaseZs可能主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。如果生物體只含有一種tRNaseZl，那么這種酶可能同時(shí)在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中發(fā)揮作用。例如黑腹果蠅D.melanogaster只有一種tRNaseZl，它具有核定位序列和線粒體定位序列，在體內(nèi)可同時(shí)加工細(xì)胞核和線粒體tRNA前體［20］。蛋白亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，芽殖酵母的tRNaseZl位于細(xì)胞核和線粒體中Ri］，裂殖酵母的2個(gè)tRNase21分別定位于細(xì)胞核和線粒體中，提示它們可能分別在細(xì)胞核和線粒體中參與tRNA前體3'末端的加工⑹。序列分析顯示，人的ELAC2的N-端含有一個(gè)很強(qiáng)的線粒體信號(hào)肽，但不清楚ELAC2是否同時(shí)參與細(xì)胞核和線粒體tRNA前體3'末端的加工。某些真核生物出現(xiàn)兩種類(lèi)型的tRNaseZ，暗示了它們可能在細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用。tRNaseZL?tRNaseZs除了有不同的細(xì)胞定位、不同的最適反應(yīng)條件外，它們識(shí)別和催化的底物也有不同。tRNaseZl即能以正常pre-tRNA為底物，也能識(shí)別變異的pre-tRNA；tRNaseZs只能催化正常pre-tRNA，這種差異可能是因?yàn)閠RNaseZlN-端具有底物結(jié)合特異性㈤。1.2.2tRNaseZ的功能前體tRNA3'末端由核酸內(nèi)切酶參與加工早在30年前就被發(fā)現(xiàn)［37-38］。然而直到2002年，相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶的蛋白和基因序列才被確定［19］。研究者首先從小麥胚胎中分離純化出一種大小為43kDa的蛋白具有相應(yīng)的pre-tRNA3'末端加工活性，再通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序獲得了這種蛋白的蛋白質(zhì)序列以及相應(yīng)的基因序列；通過(guò)在體外表達(dá)擬南芥(Arabidopsisthaliana)和甲烷球菌(Methanococcusjanaschii)中該蛋白的同源蛋白，證實(shí)它們都具有pre-tRNA3'末端加工活性。這種蛋白就是我們今天所熟知的tRNase2。自此，關(guān)于tRNA3'端加工成熟的研究有了飛速進(jìn)展，并有數(shù)種tRNaseZ的晶體結(jié)構(gòu)被解析。目前，已獲得的關(guān)于tRNaseZ的研究數(shù)據(jù)多來(lái)自體外實(shí)驗(yàn)。迄今為止，所有在體外重組表達(dá)的tRNaseZs和tRNaseZl都具有pre-tRNA3'末端加工活性［39-44,34］；而關(guān)于tRNaseZ體內(nèi)生物學(xué)功能的研究報(bào)道相對(duì)較少。Pellegrini等［40］發(fā)現(xiàn)，抑制枯草桿菌tRNaseZs的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致不含CCA的pre-tRNA的積累，但對(duì)含CCA的pre-tRNA沒(méi)有影響。在果蠅中，通過(guò)RNA干擾的方法沉默tRNaseZl的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核和線粒體中3'末端未加工的tRNA前體的積累，表明果蠅tRNaseZl同時(shí)參與細(xì)胞核和線粒體pre-tRNA3'末端的加工㈣。本課題組最近的研究結(jié)果也顯示，在粟酒裂殖酵母La蛋白(Slalp)缺失菌株中，tRNaseZli(SpTrzlp)至少對(duì)于部分pre-tRNA3'末端的加工是必需的［24］。所有的體外實(shí)驗(yàn)都顯示tRNaseZ具有pre-tRNA3'末端加工活性，體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示tRNaseZ在體內(nèi)參與了pre-tRNA3'末端加工，因此，有理由認(rèn)為pre-tRNA3'末端加工活性是tRNase的主要功能，但這并不能排除tRNase2在體內(nèi)還具有其它生理功能。比如芽殖酵母tRNaseZl基因?yàn)楸匦杌騾s并非因?yàn)閜re-tRNA3'末端加工功能，因?yàn)檠恐辰湍傅暮藀re-tRNA3'末端加工還有備份的外切核酸酶途徑［25］，而線粒體RNA代謝在含葡萄糖培養(yǎng)基中是非必需的［47］。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，芽殖酵母的tRNaseZl溫敏突變型菌株能夠被人EX2基因互補(bǔ)救活；Rex2p蛋白是定位于線粒體中的一種外切核酸酶，參與包括U4snRNA、5.8SrRNA、U5snRNA、RNasePRNA等小分子RNA的加工成熟；因此，芽殖酵母tRNaseZl還可能參與線粒體中小分子RNA的加工㈣。大腸桿菌的tRNaseZ參與某些特殊mRNA的降解作用四。在線蟲(chóng)中，tRNaseZ是種系增殖所必需的，降低tRNaseZ的表達(dá)量會(huì)引起不育性的產(chǎn)生仍］。果蠅的tRNaseZ能夠被保幼激素誘導(dǎo)，暗示其可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化［29］。人ELAC2能夠與y-微管蛋白復(fù)合體相互作用，高表達(dá)ELAC2能夠?qū)е录?xì)胞循環(huán)進(jìn)程的延遲［30］。tRNaseZ與疾病目前已發(fā)現(xiàn)有120種tRNA基因的突變與疾病相關(guān)，其中有些突變和tRNA前體3'末端的加工有關(guān)。例如人的tRNA前體3'末端加工酶的基因［31］ELAC2突變會(huì)導(dǎo)致前列腺癌［32］，但這種致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。線粒體tRNA基因的突變與疾病緊密相關(guān)。例如，線粒體DNA7445A-G突變與非綜合征型耳聾的發(fā)病有關(guān)［33］，這個(gè)突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄成的線粒體tRNASerUCN前體中的“區(qū)別堿基”后的U74突變?yōu)镃。體外研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變使tRNase2不能加工線粒體tRNASe、CN前體的3'末端，說(shuō)明tRNA前體3'末端加工的缺陷可能會(huì)導(dǎo)致某些疾病。1.4粟酒裂殖酵母粟酒裂殖酵母是一種單細(xì)胞真核微生物，最初是從東非粟米啤酒中分離到的，該酵母因此得名，在1890年從東非傳到德國(guó)，后來(lái)進(jìn)一步得到培養(yǎng)出純菌種。P.inder首次在1893年的釀造雜志中用德文記錄了裂殖酵母，并命名為“pombe”，在斯瓦希里語(yǔ)中是啤酒的意思。粟酒裂殖酵母的無(wú)性繁殖方式全都是裂殖，因而又稱(chēng)為裂殖酵母，有單倍體和雙倍體兩種營(yíng)養(yǎng)體，雙倍體可產(chǎn)生孢子。其在許多方面與較之復(fù)雜很多的真核生物有相似性。通過(guò)基因序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析，它與芽殖酵母在3.3?4.2億年前已經(jīng)分化，而與后生動(dòng)物在10?12億年以前已經(jīng)分化［34］。粟酒裂殖酵母和芽殖酵母之間基因序列的差異程度與它們和人類(lèi)之間基因序列的差異程度相當(dāng)，這提示真菌的進(jìn)化速度比后生動(dòng)物更快。在真核生物中，對(duì)粟酒裂殖酵母進(jìn)行遺傳操作的簡(jiǎn)便性?xún)H次于芽殖酵母，這使得其成為進(jìn)行細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂和無(wú)絲分裂［35］、DNA修復(fù)和重組研究［36］的模式生物，裂殖酵母基因組全序列已在2002年被測(cè)定［35］。粟酒裂殖酵母單倍體染色體基因組的大小為13.8Mb，分布在三條染色體上，其大小分別為5.7Mb(I)、4.6Mb(II)和3.5Mb(III)。粟酒裂殖酵母含有4824個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)(芽殖酵母超過(guò)5500個(gè))，是已知真核生物中最少的，甚至比一些細(xì)菌還少。因而，粟酒裂殖酵母作為一種模式系統(tǒng)運(yùn)用于粟酒裂殖酵母的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)非常成熟，便于開(kāi)展各種研究。1.5粟酒裂殖酵母必需基因的研究方法維持某種生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因被稱(chēng)為是這個(gè)物種的必需基因，如果這個(gè)基因被敲除細(xì)胞就會(huì)表現(xiàn)出致死表型。目前粟酒裂殖酵母的許多必需基因的分子功能和遺傳功能沒(méi)有被詳細(xì)的研究，主要一部分原因是很難用這些必需基因的缺失突變型進(jìn)行研究。應(yīng)用于粟酒裂殖酵母失活必需基因的方法有以下幾種：一種是構(gòu)建該基因的條件致死突變體，條件致死突變體的生長(zhǎng)和代謝特點(diǎn)能夠通過(guò)簡(jiǎn)單地改變培養(yǎng)條件，例如溫度進(jìn)行控制，被認(rèn)為是遺傳和生化研究的有力工具［37-38］。另一種是采用可以迅速被抑制的啟動(dòng)子置換原有啟動(dòng)子的方法來(lái)關(guān)閉目標(biāo)基因的表達(dá)。第三種是構(gòu)建熱誘導(dǎo)的降解決定子(heat-inducible-degron)結(jié)構(gòu)域與編碼序列相融合的基因。用可熱誘導(dǎo)的降解決標(biāo)記目標(biāo)蛋白，帶有標(biāo)記物的目標(biāo)蛋白在37^被降解而失活［39］。這里主要介紹前兩種方法。溫度敏感型突變是指僅在某個(gè)溫度范圍內(nèi)顯有與野生型不同表型的突變型。其中包括在某個(gè)溫度以上顯示出和野生型不同表型的高溫敏感突變型，及在某個(gè)溫度以下才顯有與野生型不同表型的低溫敏感突變型。一般來(lái)說(shuō)，高溫敏感突變型是由于突變基因的產(chǎn)物(某種特定的蛋白質(zhì)或RNA)在高于某種溫度時(shí)不穩(wěn)定，失去了其原有功能，結(jié)果它的表型就成為高溫敏感。如果發(fā)生這類(lèi)突變的基因控制的特性是生長(zhǎng)繁殖不可缺少的，那么就會(huì)形成條件致死突變型。在實(shí)驗(yàn)中，只要改變培養(yǎng)溫度就可不斷觀察到這類(lèi)突變型的表型如何從野生型變到突變型，溫度敏感型突變體對(duì)溫度適應(yīng)性的變化涉及到一系列生理生化特性的改變，體現(xiàn)了基因功能結(jié)構(gòu)域突變后基因功能的異常。因此，溫度敏感型突變體提供了研究功能基因的好材料，是研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作的良好體系，成為研究基因結(jié)構(gòu)與功能的有效手段［40］。但是溫度敏感型突變體產(chǎn)生的機(jī)率很低，篩選突變體比較困難。

1.6遺傳學(xué)方法篩選抑制基因在酵母中進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)是一種研究基因功能的常用方法。對(duì)酵母中某個(gè)經(jīng)突變或敲除而在細(xì)胞水平表現(xiàn)出明顯表型的基因，用外源表達(dá)的基因進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酵母細(xì)胞能否恢復(fù)為正常表型，這一實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)成為對(duì)目標(biāo)基因的功能進(jìn)行分析的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案［41］。涉及到功能互補(bǔ)分析的實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中必須注意多方面的問(wèn)題，因?yàn)楹芏嘁蛩貢?huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)不穩(wěn)定的結(jié)果，這些因素包括所用的載體的拷貝數(shù)、所用的用于篩選的抗生素的性質(zhì)、載體中啟動(dòng)子的類(lèi)型及啟動(dòng)強(qiáng)度、啟動(dòng)子和插入基因間的距離、外源基因的序列特征等［42］。很多情況下，簡(jiǎn)單地提高基因的劑量就會(huì)產(chǎn)生完全不同的表型。通過(guò)遺傳相互作用篩選與某一突變基因間存在功能互補(bǔ)的基因，這一研究方法的原理可以歸結(jié)為以下：a）抑制子產(chǎn)物可以“幫助”突變基因產(chǎn)物以穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)存在；b） 抑制子產(chǎn)物作為“替補(bǔ)”，與突變基因產(chǎn)物的配體進(jìn)行相互作用；c） 抑制子產(chǎn)物激活旁路代謝途徑；d） 抑制子產(chǎn)物是能識(shí)別無(wú)義突變的tRNA分子，并通過(guò)在該無(wú)義突變位點(diǎn)插入氨基酸而“修正”該無(wú)義突變。Suppressorotvdd-typcDirtrieratibzesprotc^Suppressorotvdd-typcDirtrieratibzesprotc^MutantWildtype Proter'3destabztd①幺oooSbInteractionsuppressor:allelespecific,genespecificWildtype Mutant SuppressorM C4 EGcBypasssuppressor:pathwayspecific,pbseubsnullalleleWild-type

pathwayMutantBccksoWild-type

pathwayMutantBccksore

pithvjaySuppressorOpensatE「「iativepithvjay、,圖1.3高表達(dá)抑制基因作用的原理 X摘自：SusanL.Forsburg:Theartanddesignofgeneticscreens:yeast.dNonsensesuppressar:allelespecific,genenon-specificWild-type

proteinSuppressor

tRNAWild-type

proteinSuppressor

tRNAr&cognz&sPrematureytermrtat&d

by codonN-cccaxcoocoon-occooxn-ccocooocooooN-cccaxcoocoon-occooxn-ccocooocoooo1.7GFP研究進(jìn)展有NLS介導(dǎo)的蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中物質(zhì)交流的重要環(huán)節(jié)，對(duì)細(xì)胞的增值，分化，調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化起著重要的作用。因而對(duì)NLS的研究成了細(xì)胞科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。鑒定NLS的第一步常用的是確定目的蛋白與示蹤蛋白分子融合，已明確全長(zhǎng)蛋白的定位情況，再根據(jù)預(yù)測(cè)的情況，將全長(zhǎng)分子切割成若干截短突變體，通過(guò)觀察這些突變體的定位情況明確NLS的具體位置。目前在觀察蛋白質(zhì)定位時(shí)常用的是綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱(chēng)GFP)或者加強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，簡(jiǎn)稱(chēng)EGFP)。綠色熒光蛋白是海洋生物水母體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白，分子量27KD，有238個(gè)氨基酸組成，該蛋白65-67位Ser-Tyr-Gly三種氨基酸環(huán)化加氧形成特殊的生色團(tuán)結(jié)構(gòu)，這一氧化和環(huán)化過(guò)程不需要任何