菠蘿蜜總rna提取方法比較

羅地亞和金針茅的又名木托羅、木托羅、木托羅、蜜年份、蘑菇和狗腸草。它屬于薔薇科和莫拉齊亞木托羅。它是印度的一種亞熱帶水果。1材料和方法1.1果實(shí)采集和處理供試菠蘿蜜品種為‘馬來西亞1號(hào)’,采集地點(diǎn)為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所水果種質(zhì)資源圃。選3株掛果樹,隨機(jī)采集健康無病蟲害的葉片共計(jì)15張;為了便于運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室且減少供試材料的浪費(fèi),每株樹采摘1枚單果質(zhì)量在15kg以下果實(shí),共計(jì)3枚。上述材料采摘后立即帶回實(shí)驗(yàn)室,用干凈紗布清潔葉片表面浮塵,帶一次性乳膠手套取出種子,清洗種子,然后用濾紙吸干表面水分,將葉片和種子分別放入封口袋內(nèi),置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆脤⒀欣彙⒀心グ?、藥匙、試劑瓶、玻璃儀器、手術(shù)刀、醫(yī)用剪刀等用0.5%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡過夜,然后放入高溫滅菌箱,于190℃處理6h;將藍(lán)色槍頭、黃色槍頭和離心管等塑料制品設(shè)備用0.5%DEPC水溶液浸泡過夜,然后放入烘箱,于55℃烘干;將1mol/LKOH放入電泳槽,保持6V/cm的電泳強(qiáng)度電泳5h,對(duì)電泳槽進(jìn)行滅菌1.2方法1.2.1材料處理1采用液氮預(yù)冷研磨法將液氮注入保溫桶內(nèi),1min后將研缽、研磨棒、藥匙和離心管放入保溫桶內(nèi)預(yù)冷,液氮應(yīng)沒過所放入的試驗(yàn)器皿,1min后將所有試驗(yàn)器皿取出待用。在預(yù)冷試驗(yàn)器皿時(shí),去除菠蘿蜜葉片較大的主脈和側(cè)脈,將去除葉脈的葉片放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)待研磨。向研缽倒入液氮,用研磨棒將葉片碾碎,其間放入少許聚乙烯吡咯烷酮(PVP),待液氮汽化將結(jié)束時(shí)迅速研磨,研磨葉片成綠色干粉狀即可。將葉片干粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷過的離心管中,置于-70℃冰箱中保存待用。2菠蘿蜜種子研磨液氮預(yù)冷試驗(yàn)器皿同上。用酒精燈的外焰灼燒手術(shù)刀,至刀刃變紅色后20s,將手術(shù)刀插入碎冰渣中降溫。用手術(shù)刀將菠蘿蜜種子切割成1mm厚的薄片。將薄片放入事先盛有液氮的研缽中,用研磨棒將薄片碾碎,待液氮汽化將要結(jié)束時(shí),放入少許PVP粉末迅速研磨,重復(fù)此操作,直至菠蘿蜜種子被研磨成白黃色粉末為止。將白黃色粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管內(nèi),迅速放入-70℃冰箱中保存待用。1.2.2離心管提取沉淀操作步驟如下:(1)在研磨好的干粉內(nèi)加入2mLTrizol試劑(天根生化科技有限公司),上下顛倒溶合,將離心管放在振蕩器上振蕩8min,靜置1min;(2)加入等體積飽和酚(pH4.3)、氯仿和異戊醇的混合液(體積比為25∶24∶1),上下顛倒混勻并在振蕩器上振蕩30s,4℃下,11555r/min渦旋15min;(3)取1.5mL上清液轉(zhuǎn)移到無RNase的離心管中;(4)加入等體積的氯仿和異戊醇的混合液(體積比為24∶1),上下顛倒混勻,在冰上靜置5min,此操作重復(fù)1～2次;(5)取1mL上清液,加入等體積異丙醇,混勻,冰上置20min,4℃下,11555r/min渦旋18min,留沉淀;(6)用預(yù)冷過的75%乙醇適量洗滌沉淀,4℃下,11555r/min渦旋5min,留沉淀,重復(fù)此操作2～3次;(7)放入通風(fēng)窗內(nèi)抽風(fēng)干燥,用100μLDEPC溶解,放入-70℃冰箱中保存待用。23tir-硼酸提取法參考劉艷娜等32萃取試劑盒的方法試劑盒(北京天根生化科技有限公司)貨號(hào)DP419,規(guī)格50次。具體操作步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。1.2.3rna質(zhì)量檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量(瓊脂糖0.8%);使用紫外分光光度計(jì)讀取吸光度值,計(jì)算230、260和280nm吸光度之間的比值分析RNA質(zhì)量;使用Agilent2100儀器檢測(cè)RNA的完整性。1.2.4tgaatctgaatctg、tgactg、tgactg、tdgetgatg利用Actin基因在任何植物組織中均能穩(wěn)定表達(dá)的原理,利用primer5.0設(shè)計(jì)正反向引物,分別為:GTGCTCGAATCTGGTGATGC;AATTCCGGTTCCGCTGTG。20μL擴(kuò)增體系為:2μL的10×PCR緩沖液,1μL的5.0mmol/LdNTP,各0.5μL的10μmol/L正反引物,0.3μL的5U/μLTaqDNA聚合酶,1μL的cDNA,加ddH2結(jié)果與分析2.1采用3種方法所提取rna的質(zhì)量及產(chǎn)量比較分析Trizol提取法、Tirs-硼酸提取法和試劑盒提取法所提取菠蘿蜜葉片和種子的總RNA,結(jié)果見表1。由表1可知,使用這3種方法均能提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA,但所提取RNA質(zhì)量和產(chǎn)量不同。使用這3種方法提取時(shí),其葉片RNA產(chǎn)率均大于種子RNA產(chǎn)率。使用這3種方法所提取RNA的A從操作難度、耗時(shí)、成本、RNA質(zhì)量和產(chǎn)量5個(gè)方面對(duì)3種提取方法進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。由表2可知,每種方法各有優(yōu)勢(shì),其中試劑盒提取法更適于菠蘿蜜葉片和種子RNA的提取。2.2種方法所提取rna的表達(dá)RNA凝膠電泳圖譜是最直觀判斷RNA質(zhì)量的手段,根據(jù)18S、28S和5SRNA條帶的帶型和亮度可以判斷RNA的提取質(zhì)量。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠上,用3種方法所提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA電泳結(jié)果如圖1所示。使用3種方法均可提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA,且28S條帶亮度均大于18S條帶亮度。其中,采用Trizol提取法和Tirs-硼酸提取法所提取總RNA亮度較高,采用試劑盒提取法所提取總RNA亮度相對(duì)較暗,這與表1中總RNA濃度結(jié)果相一致,總RNA濃度越高條帶亮度越亮。采用試劑盒提取法所提取RNA未能觀察到5S條帶,這也與表1中各濃度數(shù)據(jù)相一致。綜合來講,采用3種提取方法均可以獲得帶型完整、層次分明的總RNA,可用于后續(xù)相關(guān)研究。2.3rna的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以采用3種方法所提取的菠蘿蜜葉片和種子總RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知,所提取RNA樣品均可被檢測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其片段約200bp。2.4菠蘿蜜葉片和種子rna的檢測(cè)在Agilent2100電泳檢測(cè)中,即便是微弱的降解也可表現(xiàn)出來,RNA質(zhì)量越好,其28S和18S的峰積分面積越大,其余雜峰越少且峰積分面積越小,同時(shí)28S峰積分面積接近18S峰積分面積的2倍,表明RNA質(zhì)量較好。采用3種提取法所提取菠蘿蜜葉片和種子RNA共計(jì)6份樣品,通過Aiglent2100檢測(cè)得到6份樣品電泳圖譜,結(jié)果如圖3所示。由圖3可見,6份電泳圖譜均存在雜峰,且采用3種提取方法所提取種子總RNA所得雜峰總體較所提取葉片總RNA多。采用Tris-硼酸法所提取葉片和種子RNA樣品電泳圖譜的雜峰明顯高于其他電泳圖譜,說明采用Tris-硼酸提取法所得到的菠蘿蜜葉片和種子總RNA質(zhì)量較差;采用試劑盒提取法所提取葉片和種子RNA樣品電泳圖譜的雜峰較少,雜峰積分面積也較小,28S和18S峰積分面積較大,且28S峰積分面積達(dá)到18S峰積分面積的2倍,表明試劑盒提取法是提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA較好的選擇。Agilent2100電泳圖譜結(jié)果與紫外分光光度檢測(cè)、凝膠電泳結(jié)果基本一致,與RIN值結(jié)果吻合。3采用試劑盒法所提取總rna的質(zhì)量檢測(cè)Trizol提取法、Tris-硼酸提取法和試劑盒提取法是常用的3種提取木本果樹RNA的方法,按照其提取試劑組分比例及操作流程可以較大概率得到理想RNA。本試驗(yàn)中采用這3種方法提取菠蘿蜜葉片和種子的總RNA,均可得到理想效果的總RNA電泳圖和RT-PCR電泳結(jié)果?？俁NA質(zhì)量和產(chǎn)率分析結(jié)果表明,采用3種提取方法所得總RNA的A菠蘿蜜葉片和種子中富含酚類、單寧等次生代謝物質(zhì)以及大量纖維和淀粉,這些物質(zhì)嚴(yán)重干擾高質(zhì)量總RNA的提取與Trizol提取法相比,雖然Tirs-硼酸提取法加入β-巰基乙醇和乙醇等保護(hù)試劑,采用該方法所得菠蘿蜜葉片和種子總RNA產(chǎn)率與采用Trizol提取法所得結(jié)果相近,但其A在采用試劑盒法所提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖中雖未見5S條帶,但28S和18S條帶清晰可見,且RT-PCR電泳結(jié)果中在約200bp處有cDNA條帶出現(xiàn),說明RNA完整性較好;A以往有關(guān)植物總RNA提取方法的研究報(bào)道中鮮有涉及Agilent2100檢測(cè),Agilent2100檢測(cè)可以高靈敏地檢查最細(xì)微的RNA降解。Agilent2100檢測(cè)結(jié)果表明,采用試劑盒法所提取菠蘿蜜葉片和種子總RNA的電泳圖譜雜峰極少,雜峰積分面積小,有明顯的28S峰積分面積和18S峰積分面積,且28S峰積分面積是18S峰積分面積的2倍,而采用其他提取方法的28S峰積分面積未達(dá)18S峰積分面積的2倍,且采用Tirs-硼酸提取法所提取總RNA電泳圖譜存在較多的雜峰。