表達(dá)ndvf蛋白的mdv疫苗株cvi488bac重組病毒的構(gòu)建

馬麗氏病（md）是馬麗氏?。╩dv）引起的嚴(yán)重免疫抑制和內(nèi)臟腫瘤的重要疾病。疫苗免疫可有效預(yù)防雞發(fā)生MD，降低死亡率新城疫(newcastledisease,ND)是由副黏病毒科的新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，被我國(guó)列為A類動(dòng)物疫病。疫苗接種是預(yù)防ND發(fā)生的主要方法。1945年，ND滅活疫苗在美國(guó)批準(zhǔn)銷售，但因其無法完全預(yù)防疾病且成本較高，未被廣泛使用F蛋白是NDV的主要抗原和毒力因子，參與病毒感染入侵及細(xì)胞間傳播1材料和方法1.1聚合酶、rtaq基因及雞胚pcDNA3.1-F-kana質(zhì)粒、CVI988BAC質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;2KplusⅡMarker、PrimeSTARMaxDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司;胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。1.2f基因的集合，cmi988bac的裝載1.2.1pcna擴(kuò)增通過Primer5設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表1)，分別用于UL3/4位點(diǎn)的F-Kana基因的擴(kuò)增以及陽(yáng)性克隆篩選鑒定。以pcDNA3.1-F-Kana質(zhì)粒為模板擴(kuò)增F-Kana片段，反應(yīng)體系為50μL:PrimeSTARMaxDNA聚合酶25μL，上下游引物各1μL，模板1μL，補(bǔ)水至50μL。反應(yīng)程序:95℃5min,(95℃30s,55℃30s,72℃3min)×30個(gè)循環(huán)，72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。1.2.2阿拉伯糖誘導(dǎo)i-scei基因缺失菌株的構(gòu)建將實(shí)驗(yàn)室保存的CVI988BAC菌株活化，42℃熱激15min，冰浴3～5min，離心棄去上清，制備感受態(tài)細(xì)胞，向感受態(tài)細(xì)胞中加入回收的目的片段，輕彈混勻，移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置電轉(zhuǎn)儀程序1800V,100Ω，2.5μF進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入1mLSOC,30℃孵育3h后，涂布于含有氯霉素(25μg/mL)、氨芐(50μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)抗性平板上，30℃培養(yǎng)48h，篩選陽(yáng)性單克隆菌株。然后向陽(yáng)性菌液中加入終濃度為0.5%的阿拉伯糖誘導(dǎo)I-SceI內(nèi)切酶表達(dá)進(jìn)而敲除Kana抗性基因。48h后將板上的單個(gè)菌落接種到氯霉素、氨芐抗性平板和氯霉素、氨芐、卡那抗性平板上進(jìn)行篩選，對(duì)成功去除Kana抗性基因的菌落進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽(yáng)性菌株。1.3病毒的急救和重組將雞胚成纖維細(xì)胞(chickembryofibroblast,CEF)培養(yǎng)于含有5%FBS的DMEM中，置于37℃，5%CO1.4sds-采用凝膠電泳分別取500PFUCVI988BAC-F病毒、CVI988BAC病毒接種到鋪滿CEF的60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同時(shí)設(shè)置不接種病毒的CEF細(xì)胞作為空白對(duì)照，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)收獲細(xì)胞，冰浴PBS洗滌2次，加入500μLRIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置5min后刮下細(xì)胞，14000g離心10min，吸取上清，加入5×SDS上樣緩沖液100℃煮沸10min，取20μL進(jìn)行SDS凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，加入5%的1×PBST稀釋的脫脂牛奶，室溫封閉1h，分別用2mL1∶2000倍稀釋的MDVgB單克隆抗體和NDV多抗血清室溫孵育1h,PBS洗滌3次，每次5min，然后分別加入2mL1∶3000倍稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗雞二抗，室溫孵育1h,PBS洗滌3次，每次5min，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，利用GEHealthcare蛋白成像系統(tǒng)成像。1.5mdvgb單克隆抗體和ndv多抗血清的制備利用間接免疫熒光(indirectimmunofluorescence,IFA)檢測(cè)重組病毒蛋白的表達(dá)。檢測(cè)步驟簡(jiǎn)述如下:取100PFU拯救的病毒接種到35mm細(xì)胞平皿中，同時(shí)設(shè)置不接種病毒的對(duì)照組，感染5～7d后細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，向每個(gè)平皿中加入1mL冰凍的細(xì)胞固定液(甲醇∶丙酮=3∶2)，室溫固定4min后，將細(xì)胞固定液用移液槍沿側(cè)壁吸出，在通風(fēng)櫥下吹干。向固定好的細(xì)胞板中加入5%的1×PBS稀釋的脫脂牛奶，室溫封閉30min。PBS洗滌3次，每次5min，分別在細(xì)胞平皿上加入500μL1∶500倍稀釋的MDVgB單克隆抗體和NDV多抗血清，室溫孵育45min。將孵育過MDVgB單克隆抗體和NDV多抗血清的細(xì)胞平皿用PBS洗滌3次，分別加入500μL1∶500稀釋FITC標(biāo)記的羊抗鼠或者羊抗雞二抗，室溫避光孵育45min。將二抗孵育后的細(xì)胞板用PBS洗3次，每次5min，然后加入100μL15%甘油，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)挑選50個(gè)病毒蝕斑成像，利用ImageJ軟件對(duì)蝕斑大小進(jìn)行測(cè)定，使用軟件GrapraphPadPrismversion8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，且進(jìn)行3次重復(fù)。1.6病毒復(fù)制特性檢測(cè)將CVI988BAC-F和CVI988BAC病毒分別接種于鋪滿CEF的6孔板中，每孔100PFU，分別在接毒后1d、3d、5d收獲細(xì)胞，采用苯酚氯仿法提取細(xì)胞DNA，以雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin,OVO)作為內(nèi)參，通過qPCR測(cè)定病毒基因ICP4的循環(huán)閾值(CT值)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出病毒的復(fù)制數(shù)以比較重組病毒和親本毒株的復(fù)制特性2結(jié)果2.1pcr擴(kuò)增f-kana片段以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pcDNA3.1-F-Kana質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增F-Kana片段，成功擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段，片段大小為3706bp(圖1)。2.2陽(yáng)性菌pcr鑒定結(jié)果將PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收，利用同源重組的方式將F-Kana基因整合到CVI988BAC載體上，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，通過對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，成功獲得預(yù)期大小為4178bp片段的陽(yáng)性菌(圖2)。將鑒定的陽(yáng)性菌接種到含有氯霉素、氨芐青霉素抗性的液體2×YT培養(yǎng)基上，對(duì)該陽(yáng)性菌進(jìn)行Kana基因的敲除，隨后進(jìn)行PCR鑒定，成功篩選獲得了預(yù)期大小為3149bp片段的陽(yáng)性菌(圖3)。2.3病毒-b和cvi988bac-b檢測(cè)將Qiagen試劑盒提取的重組質(zhì)粒CVI988BAC-F轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后7天出現(xiàn)明顯的病毒蝕斑，對(duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將收獲的病毒置于液氮罐凍存并定量。將收獲的病毒取500PFU接種于鋪滿單層CEF的60mm平皿中，待出現(xiàn)明顯病毒蝕斑后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，分別用gB抗體和NDV多抗血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體和羊抗雞抗體作為二抗進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示，CVI988BAC和CVI988BAC-F中均能夠檢測(cè)到gB蛋白的表達(dá)，用NDV多抗血清均可檢測(cè)到CVI988BAC-F和雞新城疫活疫苗(LaSota株)中F蛋白的表達(dá)(圖4A)。分別以NDV多抗血清和MDVgB單抗為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗雞和羊抗鼠抗體分別作為NDV多抗和gB抗體的二抗進(jìn)行IFA驗(yàn)證，在熒光倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染重組病毒的CEF細(xì)胞板上可以觀察到特異的綠色的熒光(圖4B)。以上結(jié)果表明，從CEF細(xì)胞中成功拯救重組疫苗病毒。2.4重組病毒的蝕斑大小檢測(cè)分別將100PFU的CVI988BAC和CVI988BAC-F接種于鋪滿CEF的6孔板，收取1d、3d、5d的細(xì)胞，提取細(xì)胞DNA，測(cè)定病毒拷貝數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線(圖5A)。結(jié)果表明，CVI988BAC-F同親本株CVI988BAC在CEF上的增殖無顯著性差異。同時(shí)對(duì)隨機(jī)挑選的50個(gè)病毒蝕斑的面積進(jìn)行測(cè)定分析(圖5B和5C)，重組CVI988BAC-F與親本毒株的蝕斑大小無顯著差異。這些結(jié)果表明，在CVI988BAC中插入NDVF基因不影響病毒的體外增殖。3．重組病毒的鑒定以MDV為載體的重組載體疫苗，在載體疫苗研究中應(yīng)用較早，且在多種病毒疫苗研發(fā)中進(jìn)行了嘗試，具有較好的應(yīng)用效果。Darteil等隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗技術(shù)日趨成熟，基因工程疫苗和傳統(tǒng)疫苗相比具有高產(chǎn)量、高純度和較高的安全性。常用的構(gòu)建疫苗的基因工程技術(shù)中，自然重組技術(shù)非定向，容易出現(xiàn)基因組DNA錯(cuò)配，可能對(duì)重組病毒的生物學(xué)特性造成很大影響;利用黏粒技術(shù)操作的DNA片段較小，整合后基因組不穩(wěn)定，且過程繁瑣，成功率低疫苗的使用降低了MDV和NDV感染的致病率和致