nf-、il-6在大鼠實驗型胰性腦病中對腦組織作用的研究

胰腺疾?。╬e）是胰腺疾病的一種獨特的精神和神經(jīng)系統(tǒng)變化。并發(fā)癥危險，死亡率高，但病機不全。目前對PE發(fā)生機理普遍的理解是胰酶進入血液循環(huán),通過血腦屏障引起腦損害,其中磷脂酶A2(phospholipasesA2,PLA2)的作用引人注目。PLA2活化后可將膽汁內(nèi)卵磷脂轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂,后者有破壞細胞膜磷脂層的特性,通過血腦屏障引起腦細胞脫髓鞘改變。本課題通過建立PE動物模型,觀察其腦組織病理改變情況并檢測腦組織腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)含量,以揭示TNF-α和IL-6對大鼠腦組織的損害作用,從而進一步闡明PE的發(fā)病機理,旨在為以后的臨床治療提供依據(jù)。1材料和方法1.1分組及分組方法Wistar大白鼠36只,從內(nèi)蒙古大學動物中心購買,體重200～260g,雌雄不拘,應(yīng)用拆信封法隨機分組:對照組6只;PE組30只,PE組按照完全隨機化原則分成3組為1d組,3d組、7d組,每組10只;各組動物于實驗前12h禁食,自由飲水。1.2鹽水體重、速度PE組參照苗毅等的方法從頸內(nèi)動脈注入精致豬活性PLA2(Sigma公司)復制大鼠PE模型,PLA20.1mL/100g體重,1000U/0.1mL,速度為0.05mL/min;對照組注入生理鹽水0.1mL/100g體重,速度為0.05mL/min。對照組大鼠于造模后第1d用1%氯氨酮(1mL/100g體重)腹腔注射麻醉后,腹主動脈放血處死取腦,PE組分別在造模后第1、3、7d同法各處死10只大鼠取腦。1.3濕重-干重法采用干重、濕重法測定:腦組織含水量=(濕重-干重)÷濕重×100%。將新鮮取得鼠腦的部分枕葉用電子天平直接稱濕重,然后放在80℃烤箱中36h烤干,測鼠腦的干重。1.4腦微血管及髓樣的觀察和測定①常規(guī)HE染色,參照孔雷等的大鼠腦組織觀察內(nèi)容及腦損傷評價方案進行鏡下觀察,光鏡下觀察20個腦微血管斷面,并計數(shù)20個斷面內(nèi)聚集和附壁的白細胞總數(shù),求每組的均數(shù)。②采用砂羅鉻花青法對腦組織髓鞘行特殊染色,試劑盒購自廣州儷科貿(mào)易有限公司,操作按說明書進行。垂直中線切片,片厚5μm。1.5制備20%的勻漿取部分額葉腦組織按重量:冰生理鹽水體積的比(W/V)=1∶4常規(guī)制備20%的勻漿。用雙抗體夾心ELISA法測定腦組織勻漿中TNF-α和IL-6的含量(試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)),按試劑盒操作說明的方法進行。1.6統(tǒng)計處理采用SPSS11.0軟件作統(tǒng)計學處理,實驗數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,統(tǒng)計方法用重復測量方差分析。檢驗水準α=0.05。2結(jié)果2.1造模前后大鼠的一般情況對照組大鼠麻醉清醒后即開始進食,活動不受影響;PE組大鼠于造模后第2d開始表現(xiàn)為進食減少,活動減少,反應(yīng)遲鈍,抓捕反射減弱,但隨著時間的延長,至第7d上述的表現(xiàn)沒有明顯的加重。2.2pe組與對照組腦水腫組織含水量比較大鼠腦組織的含水量PE組從造模后第1d開始就明顯高于對照組(P<0.05),表明存在腦組織水腫,且隨時間推移腦組織含水量逐漸增加,但是PE組3個時間相的腦組織含水量比較無統(tǒng)計學意義。見附表。2.3兩組il-6、tnf-含量比較腦組織勻漿TNF-α、IL-6含量從造模后第1d開始就明顯高于對照組,隨著時間的延長TNF-α、IL-6含量明顯增加,和對照組比較一直維持在很高的水平。PE組3個時間相的比較,TNF-α和IL-6則是第7d含量和第1d比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見附表。2.4結(jié)果顯示的腦組織病理變化2.4.1各組大鼠微血管內(nèi)的細胞水腫參照孔雷等大鼠腦組織觀察內(nèi)容及腦損傷評價方案進行鏡下觀察。對照組大鼠可見散在的神經(jīng)元細胞水腫,腦組織內(nèi)沒有炎細胞的和增生聚集,腦組織的微血管內(nèi)有少數(shù)的白細胞附壁;PE組大鼠神經(jīng)元細胞水腫于造模后第1d即開始出現(xiàn),隨著時間的延長,鏡下改變表現(xiàn)為神經(jīng)元細胞水腫加重,呈氣球樣變,由較局限的神經(jīng)元細胞水腫到廣泛的神經(jīng)元水腫,染色質(zhì)邊聚;微血管內(nèi)白細胞發(fā)生聚集及附壁,其數(shù)目也隨著時間的延長而增加;腦組織內(nèi)炎性細胞的增生、聚集于第1d即開始出現(xiàn),至第3、7d,炎性細胞數(shù)目明顯增加,小血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹。見圖1。2.4.2神經(jīng)髓形態(tài)變化對照組無脫髓鞘改變;PE組造模后第1d脫髓鞘改變不明顯,從第3d開始出現(xiàn)脫髓鞘改變,第7d最為明顯,見圖2示對照組的正常神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)。神經(jīng)髓鞘染為連續(xù)鮮藍色結(jié)構(gòu);膠原纖維染為鮮紅色,細胞核核仁為藍色(砂羅鉻花青法×100)。圖2B示PE組的神經(jīng)脫髓鞘改變。神經(jīng)髓鞘的藍色變淡,髓鞘結(jié)構(gòu)不連續(xù),出現(xiàn)脫髓鞘改變(砂羅鉻花青法×100)。3tnf-參與了血管內(nèi)皮的表達近年來逐漸認識到胰酶中的PLA2不僅是引起急性胰腺炎時胰腺壞死的主要物質(zhì),而且是導致胰性腦病的重要物質(zhì),PLA2使膽汁內(nèi)的卵磷脂與腦磷脂轉(zhuǎn)變成溶血性卵磷脂和溶血性腦磷脂。溶血性卵磷脂有強烈的嗜神經(jīng)性和較強的細胞毒性,能破壞細胞膜的磷脂層,導致細胞代謝障礙,影響細胞通透性,并可透過血腦屏障進入腦循環(huán),直接引起腦組織水腫、出血、軟化壞死以及神經(jīng)細胞的脫髓鞘病變,參照苗毅等的方法從頸內(nèi)動脈注入精致豬活性PLA2(Sigma公司)直接成功復制大鼠PE模型。TNF-α主要由活化的單核細胞產(chǎn)生,是天然免疫和特異性免疫的重要介質(zhì),又是參與特異性免疫和炎癥反應(yīng)的重要因子。TNF-α低濃度時其是防御病原微生物的重要因素,濃度過高則可導致一系列炎性損害。TNF-α是免疫宿主反應(yīng)的快速反應(yīng)因子,在免疫疾病中有病理性作用。TNF-α是SAP過程中介導腦組織損害的重要炎性介質(zhì)之一,主要機理有:①TNF-α可刺激PLA2的分化,也可直接激活PLA2;②TNF-α可促進多核白細胞的積聚和激活,激活的白細胞在TNF-α作用下可釋放增強毛細血管通透性的細胞介質(zhì),這些介質(zhì)包括血小板活化因子、IL-6、IL-2、IL-8、一氧化氮、血栓素A2、前列腺素、氧自由基等,炎性介質(zhì)又可正反饋促進TNF-α等細胞因子產(chǎn)生,從而形成“瀑布”樣級聯(lián)反應(yīng);③TNF-α既可直接誘導血管內(nèi)皮細胞的通透性增加,也可間接通過白細胞發(fā)揮作用;④TNF-α對血管內(nèi)皮的黏附分子有向上調(diào)作用,黏附分子向上調(diào)節(jié)可促進白細胞的黏附和收縮,造成毛細血管滲漏和組織損害;⑤TNF-α介導髓鞘的炎性損傷,刺激免疫細胞活化,造成對髓鞘的破壞,也可直接對髓鞘產(chǎn)生毒性破壞作用;⑥刺激血小板活化因子生成,誘導腦微血管血栓形成及內(nèi)皮細胞的破壞。TNF-α抗體能減輕重癥胰腺炎大鼠的腦損害,進一步證實TNF-α在PE病情發(fā)展中具有重要的意義。1980年人們發(fā)現(xiàn)成纖維細胞PolyI-C刺激后能產(chǎn)生一種抑制病毒的細胞因子,并將其命名為β2干擾素(IFN-β2),1986年即被統(tǒng)一命名為白細胞介素6(IL-6)。能產(chǎn)生IL一6的細胞有T細胞、B細胞等淋巴樣細胞以及成纖維、內(nèi)皮細胞等非淋巴樣細胞,而顱內(nèi)IL-6的主要來源是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的星形膠質(zhì)細胞。IL-6是一種多功能細胞因子,在體內(nèi)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、血細胞增生、防御機制和急性反應(yīng)反應(yīng)中起中心作用。IL-6的合成受多種細胞因子、核分裂因子和抗原的刺激而增加。IL-6作為一種致炎因子和神經(jīng)遞質(zhì),正常情況下其顱內(nèi)含量很低,但在炎癥、損傷、卒中或感染時,其表達均顯著增加。IL-6本身具有兩面性,一方面,可減輕炎癥反應(yīng),增加氧化應(yīng)急反應(yīng);另一方面,又促進神經(jīng)變性。IL-6的特征是誘導和調(diào)節(jié)急性時相反應(yīng)(acutephasereactants,APR)。IL-6通過誘導APR、出現(xiàn)白細胞增多,血管通透性增加及急性時相蛋白變化,介導SAP發(fā)生發(fā)展,出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)包括免疫功能等一系列變化;反過來這些變化又可致腸細菌異位和菌血癥,而后者又是IL-6的強誘導劑。細胞因子主要由機體的免疫細胞分泌,是一類與免疫活化和炎癥反應(yīng)有重要關(guān)系的可溶性多肽。正常情況下,人體細胞因子含量極低,但在各種因素刺激如感染、外傷后,其表達可急劇增加,過度表達可導致或加重組織損傷。細胞因子與臟器細胞受體結(jié)合發(fā)揮生物學效應(yīng),同時又可與循環(huán)的可溶性受體結(jié)合再次引發(fā)細胞因子過度釋放。重癥急性胰腺炎(SAP)伴發(fā)中毒樣癥狀與細胞因子過度產(chǎn)生引起臟器和功能損害密切相關(guān),參與的細胞因子主要有TNF-α、IL-6、IL-8、IL-l等。本實驗中,PE大鼠模型建立后,腦組織中TNF-α和IL-6含量于第1d即明顯升高,并且隨著時間的延長TNF-α和IL-6一直維持在很高的水平并且有增高的趨勢,說明TNF-α和IL-6在PE發(fā)病的7d內(nèi)對腦組織的損害一直在起作用,且隨著時間的延長,TNF-α和IL