納米納米納米納米復合材料在電化學生物傳感器中的應用

1電化學生物傳感技術近年來，生命電鉻技術和表面科學的交叉融合促進了新學科的誕生。而蓬勃發(fā)展的納米技術,特別是各種具有特殊性質(zhì)的納米材料的出現(xiàn)及應用,又為在這一領域中提出新的測試原理和檢測技術,發(fā)展新型、靈敏的電化學生物傳感器,打開了一片新天地。在方法上,追求超高靈敏度和超高選擇性的傾向?qū)е驴茖W研究由宏觀向介觀、微觀尺度的邁進,出現(xiàn)了許多新型的電極體系;在技術上,利用交叉學科方法將納米材料在光、電、磁等方面的特殊功能有機地結合運用于電極界面,從而實現(xiàn)在分子和原子水平上進行實時、現(xiàn)場和活體監(jiān)測的目的;在應用上,利用納米材料獨特的吸附性能和良好的生物相容性,構建納米-生物功能界面,為研究生命現(xiàn)象中的某些基本過程提供了可能。本文旨在從納米材料的功能角度評述近年來其在電化學生物傳感器中的應用進展,并對其發(fā)展前景做出展望。2電化學生物傳感器納米材料是指三維空間尺寸至少有一維處于納米級(通常為1~100nm)的材料。由于其特殊的尺寸分布,納米材料具有表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應,表現(xiàn)出一系列獨特的力學、電學、光學、磁學以及催化性能。在電化學生物傳感器領域引入的納米材料主要起到以下幾種作用:(1)加快電子轉(zhuǎn)移速率,增加氧化還原物質(zhì)在電極表面反應的可逆性;(2)催化反應;(3)固定生物分子;(4)標記生物分子;(5)反應控制開關;(6)作為反應物。2.1金納米粒子與碳納米管之間的耦合過程具有良好導電性能的納米材料如金屬納米粒子和碳納米管等,既能作為導線連接在生物分子與電極之間,又能起到加快異相界面電子傳遞速率的作用,增加了氧化還原物質(zhì)在電極表面反應的可逆性,是優(yōu)良的電極或電極修飾材料。金屬納米粒子(如金、銀等)和碳納米管可以作為電子導線,連接于蛋白質(zhì)(酶)與電極之間,促進蛋白質(zhì)的活性中心和電極之間的電子轉(zhuǎn)移,制備具有特殊性能的生物傳感器。Willner研究組將1.4nm的金納米粒子與葡萄糖氧化酶(GOx)的輔因子-黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)相連,然后與除去輔因子的GOx重組為新的GOx,并通過雙巰基分子將酶組裝到金電極上。該電極在測定葡萄糖時,酶與電極之間通過金納米粒子傳遞電子,其電子傳遞速率是天然酶與其天然底物氧之間電子傳遞速率的7倍。由于金納米粒子傳遞電子的速率遠快于氧,該傳感器在測定葡萄糖時不受溶解氧濃度的影響,同樣地也不受還原性物質(zhì)抗壞血酸的干擾。之后,他們又將長度為納米級的碳納米管一端固定在電極上,另一端連接上FAD,再將其除去輔因子后的GOx殘余蛋白重組為新的GOx。碳納米管也可在重組酶與電極之間象導線一樣傳遞電子,其電子傳遞速率是天然酶與其天然底物氧之間電子傳遞速率的6倍。且電子傳遞速率的快慢與碳納米管的長度有關,如使用長度為25nm的碳納米管得到的電子傳遞速率是使用長度為50nm的碳納米管時的1.5倍。徐靜娟等將17nm的金納米粒子引入層層組裝復合膜,構建葡萄糖生物傳感器。在多層膜中,金納米粒子連接于GOx與電極之間,起到了電子導線的作用,并大大加快了膜的電子傳遞速率。此外,許多生物分子如肌紅蛋白(Mb)、血紅蛋白(Hb)、細胞色素C(Cytc)、辣根過氧化物酶(HRP)等在電極上的直接電化學也可以通過金屬或金屬氧化物納米粒子及碳納米管的傳導作用進行。鞠熀先等將一種二氧化鋯的雜化復合膜和Mb共同固定在石墨電極表面,復合膜的存在加速了電極和Mb之間的電子傳遞,使得此傳感器可以在無媒介體的情況下催化還原過氧化氫,取得了良好的效果。李根喜等利用巰基DNA將金納米粒子層層組裝在金電極上,再固定Cytc。金納米粒子起到了在Cytc與電極之間傳遞電子的作用,可觀察到Cytc的直接電化學;在一定范圍內(nèi),隨著組裝金納米粒子層數(shù)的增多,Cytc的電化學響應電流增大。除了作為電子導線,金屬納米粒子和碳納米管還具有提高電化學敏感膜中電活性物質(zhì)的氧化還原可逆性的功能。Choi等用瓊脂糖將葡萄糖氧化酶和連接了二茂鐵的單壁碳納米管固定在玻碳電極表面,單壁碳納米管的引入提高了二茂鐵氧化還原反應的可逆性,同時消除了溶解氧對測定的干擾,實現(xiàn)了對葡萄糖的快速靈敏檢測。2.2其他催化劑的電化學檢測納米材料由于其粒徑小,具有高比表面積和高表面能的特點,催化效率極高。金屬及其氧化物納米粒子[15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]、碳納米材料(碳納米管、納米金剛石)[25,26,27,28,29,30,31,32,33]及普魯士藍[34,35,36,37,38,39](類普魯士藍)等納米材料因其在催化反應中展現(xiàn)出良好的性能,被廣泛的應用于電化學生物傳感器。金屬納米材料能夠催化多種電活性物質(zhì)(如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和H2O2)的氧化或還原,降低其在電化學反應中的過電位。Raj等發(fā)現(xiàn),NADH在金納米粒子摻雜的溶膠凝膠薄膜修飾電極上從-0.3V即開始氧化,在0V達到最大。Compton等發(fā)現(xiàn)銀納米粒子可以催化H2O2的還原,基于此制備的修飾電極對H2O2的檢測限為2.2μmol/L。鉑納米粒子對H2O2還有催化氧化的作用,Halaoui等通過自組裝的方法將鉑納米粒子固定在修飾了聚二烯丙基二甲胺(PDDA)的氧化銦錫(ITO)電極表面,得到了高靈敏的H2O2傳感器。由于NADH是300多種脫氫酶的輔酶,而H2O2是氧化酶的反應產(chǎn)物和過氧化物酶的底物,通過對NADH和H2O2的高選擇性測定,可以有效檢測很多種酶或底物的濃度。鈀和銥納米粒子具有和鉑類似的作用,因此也常常被用作氧化酶的固定材料檢測底物。碳納米材料,如碳納米管,因其直徑小、表面能高且原子配位不足,很容易與其它物質(zhì)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用,在電催化方面有著廣闊的應用前景。Gorski等將碳納米管分散在殼聚糖溶液中,形成碳納米管-殼聚糖復合物。該復合物具有良好的成膜性,并且對NADH表現(xiàn)出良好的催化氧化能力,NADH在該復合膜上的氧化電位降低了300mV。在對葡萄糖脫氫酶進行固定后,該傳感器可以對5.0~300μmol/L的葡萄糖進行定量檢測。陳洪淵研究組用一步電沉積法將殼聚糖包裹的多壁碳納米管固定在玻碳電極表面,它可以同時催化O2和H2O2的反應。基于此構建的生物傳感器,可以在不同的電位對底物進行檢測,能夠有效地消除抗壞血酸等電活性物質(zhì)的干擾。利用碳納米管修飾電極對H2O2或NADH的電催化作用,可以間接測定許多酶的底物和抑制劑,如膽堿、乙醇、有機磷殺蟲劑等。另外,由于DNA中的鳥嘌呤和腺嘌呤殘基可在碳納米管修飾電極上發(fā)生氧化,這種修飾電極還可以用于DNA的檢測。其它碳材料,如納米金剛石在近年來也引起了電化學研究者的注意。徐靜娟等研究發(fā)現(xiàn),電化學預處理可以顯著提高無摻雜金剛石納米粒子修飾電極的導電性和對氧氣的電催化還原能力。基于此構建了通過檢測溶解氧電流來測定葡萄糖濃度的生物傳感器(低電位檢測),排除了常見電活性物質(zhì)的干擾。普魯士藍及其同系物,對H2O2具有很強的電化學催化能力,被譽為催化H2O2還原的“模擬酶”。由于其在0V附近就可以對H2O2進行還原,檢測中可以避免多種物質(zhì)的干擾,因此普魯士藍通?？梢宰鳛殡娮用浇轶w,與氧化酶共同組裝到電極表面,通過測定氧化酶催化底物過程中產(chǎn)生的H2O2濃度來測定相應底物的濃度。夏興華研究組將普魯士藍-聚乙烯基吡啶-多壁碳納米管復合物滴涂在金電極表面,再用萘酚膜將GOx固定到復合膜上,實現(xiàn)了對葡萄糖的快速靈敏檢測。徐靜娟等將PDDA包裹的普魯士藍和GOx通過層層組裝,制備了葡萄糖傳感器,在-0.15V條件下可以測定0.15~15mmol/L的葡萄糖。此外,膽固醇、膽堿及尿酸等生物分子也可以通過用普魯士藍和相應的氧化酶構建而成的電化學生物傳感器,實現(xiàn)對其快速、靈敏和高選擇性的測定。2.3電化學和生物傳感器納米材料因具有大的比表面積、高的表面自由能、良好的生物相容性,及富含表面功能基團等特性,使得其能將大量生物分子固定到電極表面,并較好的保持其生物構型及活性,這對于生物傳感器的構建有著至關重要的作用。金納米粒子在蛋白質(zhì)固定方面應用較多,很多種蛋白質(zhì),如Hb、HRP、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶等都曾依靠金納米粒子固定到電極表面。研究表明,蛋白質(zhì)分子(酶)可以通過—NH2及—SH等基團與金的相互作用而與金納米粒子相連接。而且,由于金納米粒子具有很好的生物相容性,固定的生物分子可以較好地保持其生物活性。陳洪淵研究組利用電沉積的方法將殼聚糖-金膠-GOx共同沉積到電極表面,制備了具有快速響應的葡萄糖安培傳感器。最近,他們利用在聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面原位合成的金納米粒子,研制成生物相容性好、蛋白質(zhì)吸附能力強的聚合物-納米材料復合膜修飾電極,利用復合膜對膽堿氧化酶和乙酰膽堿酯酶的吸附位點不同,實現(xiàn)了對神經(jīng)組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的選擇性檢測。除了用于固定蛋白質(zhì)外,金納米粒子在抗原-抗體、DNA以及細胞等的固定中也發(fā)揮了巨大作用。朱俊杰等合成了一種具有三維結構的納米金膜,為抗體的固定提供一種生物相容性的微環(huán)境,發(fā)展了一種新穎的無標記免疫傳感器。鞠熀先研究組構建了一個納米金膠-殼聚糖凝膠仿生界面,利用電化學阻抗法對固定在復合膜上的K562白血病細胞的數(shù)量進行檢測,同時阻抗值的變化也可以反映細胞在膜上的增殖及凋亡。氧化物納米材料在電化學生物傳感器領域中主要應用于蛋白質(zhì)的固定。納米氧化物因其表面具有良好的親水性和生物兼容性,有利于蛋白質(zhì)保持其生物構型,通?？梢詫崿F(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)部活性中心與電極表面的直接電子傳遞。胡乃非等利用SiO2納米粒子與Hb之間的相互作用,通過層層組裝的方法將血紅素蛋白固定在石墨電極上,實現(xiàn)了它們的直接電化學。另外,他們還以血紅素蛋白為模型,討論了蛋白質(zhì)在氧化物納米粒子上固定的驅(qū)動力。2004年,陳洪淵研究組首次將SiO2納米粒子和GOx引入場效應管柵極表面,所制備的酶場效應管與不加SiO2納米粒子的酶場效應管相比,對葡萄糖響應的靈敏度有明顯的提高,使用壽命也得到延長。除了靜電相互作用,過渡金屬氧化物納米材料中的過渡金屬與蛋白質(zhì)之間還存在著鰲合作用,因此更適合固定蛋白質(zhì)。TiO2、Fe3O4、ZrO2及MnO2等納米材料在電化學生物傳感器中用于固定蛋白質(zhì)也取得了很好的效果。2.4采用分光光度法檢測ca生物分子的標記及相關的檢測一直是生命科學領域的重要內(nèi)容。采用納米材料作為生物分子的標記物,可大大改善被標記物的性能,顯著提高現(xiàn)有分析方法的靈敏度。通常,用于生物電化學分析的納米粒子標記物主要有金屬納米粒子和半導體納米粒子。在金屬納米材料中金、銀納米粒子可作為電化學分析的標記物,用于標記具有分子識別能力的生物分子如抗原、抗體和DNA等,在電化學免疫分析和DNA檢測中發(fā)揮作用。Limoges等利用金納米粒子標記抗體,通過抗體和抗原的結合將金納米粒子組裝到電極表面,然后采用陽極溶出伏安法測定金離子的濃度,從而間接測出待測抗體的濃度。該方法靈敏度高,可以測定pmol/L級的免疫球蛋白。在此基礎上發(fā)展的銀增強、銅增強的溶出方法,也被應用于抗原抗體的檢測。Limoges等將這種方法用于標記和檢測DNA,也得到具有很高靈敏度的DNA傳感器。半導體納米材料如CdS、CdTe、PbS、ZnS等由于具有多個能量態(tài),可以在多個波長被激發(fā)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,也被稱為量子點。在電化學生物傳感器領域,量子點常用于標記生物分子。通常標記有量子點的生物分子通過抗原-抗體或生物素-親和素等特異作用組裝到傳感器界面后,通過量子點組成元素的溶出伏安響應,可以定量檢測相應物質(zhì)的濃度。Wang等將CdS量子點標記到多糖上,由于多糖與金電極表面固定的凝集素之間的特異性相互作用,標記(固定濃度)和未標記(待測濃度)的CdS量子點的多糖通過競爭反應與凝集素的結合,通過測定被凝集素捕獲的Cd的溶出伏安響應,可以間接測定未標記的多糖的濃度。此外,他們還發(fā)展了一種同時檢測多種DNA的電化學方法。首先在磁性小球上固定不同的DNA片段,與較長鏈的DNA探針進行互補雜交后,再用標記了CdS、ZnS、PbS半導體納米粒子的目標DNA與之進行雜交。之后將捕獲的半導體納米粒子溶解得到金屬離子,用電化學方法測定金屬離子,就可以同時測定目標DNA的濃度。最近,鞠熀先研究組組裝了一種新的糖單層膜,由此建立了細胞表面糖的原位檢測方法。該方法以CdTe量子點為標記物,以K562細胞和甘露聚糖為目標,通過競爭反應測得單個K562細胞表面的甘露聚糖為2.3×1010個,這與先將細胞破碎、提取再用經(jīng)典的分光光度法檢測所得結果一致。這一方法集成了表面組裝、納米技術、生物技術和電化學檢測的優(yōu)點,可利用量子點的多標記能力來進行細胞表面糖的高通量多標記同時檢測。2.5催化劑的工作原理磁性納米材料由于其良好的物理化學性質(zhì)和特殊的磁性,可用作電極表面的反應控制開關,控制電催化過程以及選擇性測定待測物質(zhì)。Fe3O4是具有代表性的磁性納米材料,它的磁性可作為酶催化底物的激發(fā)信號。Willner課題組采用改變外部磁鐵的位置來轉(zhuǎn)化和控制電催化和生物電催化過程。他們將一系列電活性物質(zhì)如二茂鐵類、萘醌類、吡啶醌類以及MP-11共價結合在Fe3O4表面,通過外加磁鐵位置的變化來控制粒子的電化學活性。當磁鐵位于電極正下方時,粒子被吸引到電極表面,表現(xiàn)出電活性(開),而當磁鐵轉(zhuǎn)移到電極上方時,粒子脫離電極表面,粒子的電活性性質(zhì)處于關閉狀態(tài)(關)。利用這一轉(zhuǎn)換,可控制H2O2的電催化還原過程,以及其它生物分子如NADH和GOx的生物電催化過程的進行或終止。這種反應控制開關也可用于有選擇性的雙催化體系。Willner研究小組將二茂鐵修飾在電極表面,在溶液體系中加入吡咯喹啉醌(PQQ)-NAD+功能化的Fe3O4粒子,乳酸脫氫酶(LDH)和GOx以及兩種酶的底物。將磁鐵置于電極上方,當電極表面施加超過+0.32V的電位,以二茂鐵做媒介體的GOx催化底物過程可以發(fā)生,而乳酸的氧化受阻。當磁鐵置于電極下方并在電極上施加一定的電位時,PQQ-NAD+作為媒介體的LDH催化底物反應可以進行,而葡萄糖的氧化反應受阻。這種有選擇性的媒介體的激活可以用于選擇性測定受到干擾物影響的物質(zhì)。2.6糖脂代謝和生物傳感器的應用有些納米粒子的化學性質(zhì)不同于它的本體材料。由于高表面能的原因,納米材料的化學活性通常都高于其本體。眾所周知,本體