海藻酸鈣固定化-半乳糖苷酶的研究

0gos的合成低聚半乳液（gos）是指以（1.3）、（1.4）或（1.6）為基礎(chǔ)的半乳液糖組合，其中（1.4）主要。GOS是母乳中的天然成分，能有效促進人體內(nèi)有益細菌雙歧桿菌的生長繁殖，具有整腸、分解致癌物質(zhì)、促進鈣吸收和維生素合成等功能。GOS甜度為蔗糖的20%～40%，口感好，具有優(yōu)良的酸熱穩(wěn)定性，食用后不易引發(fā)齲齒等，可廣泛應(yīng)用于食品加工中。獲取GOS的途徑主要有3條，即從天然原料中提取、酶法合成和化學合成。但是自然界中GOS含量極少，且無色，不帶電荷，難以分離提取?；瘜W合成法需要使用大量的化學試劑，毒性大。酶法合成，尤其微生物酶法合成，原料充分、方便易得、生產(chǎn)成本低，是生產(chǎn)GOS最理想的方法。酶法合成GOS分為游離酶和固定化酶兩種。固定化酶法合成GOS具有酶利用率高、穩(wěn)定性好、GOS產(chǎn)率高、產(chǎn)物后處理工藝少等優(yōu)點，已成為GOS合成研究的熱點。本文對海藻酸鈣固定化米曲霉β-半乳糖苷酶的方法、固定化酶的特性以及用于從乳糖直接合成GOS的試驗結(jié)果給予報道。1材料和方法1.1聚羧酸檢測試劑米曲霉β-半乳糖苷酶：自制；考馬斯亮藍G-250：英國進口分裝；葡萄糖測定試劑盒：上海榮盛生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉、乳糖、戊二醛：分析純。1.2培養(yǎng)箱、儀器和水電池HWY-100B恒溫培養(yǎng)搖床、DG-401型電熱恒溫培養(yǎng)箱、YY0088-92型微量進樣器、722型分光光度計、FA2004電子天平。1.3實驗方法1.3.1海藻酸鈉硬化將一定濃度的海藻酸鈉與酶液按一定比例混合，在37℃水浴中使海藻酸鈉融化，用注射器逐滴滴入氯化鈣溶液中，操作完畢后，移4℃冰箱中硬化2h，過濾洗滌，加入戊二醛溶液交聯(lián)4h，洗滌，測定酶活力。1.3.2g固定化酶活力測定在10mL1%(w/v)乳糖底物(pH6.0的磷酸緩沖液配制)中加入2g固定化酶，在200r/min、50℃反應(yīng)10min后，用葡萄糖試劑盒測定酶活力。酶活單位定義為：在55℃、pH6.0條件下，每分鐘釋放1μmol葡萄糖所需的酶量為1個活力單位。固定化酶的活力回收率按下式計算：1.3.3糖組分的檢測取一定量pH為5.5、30%乳糖溶液，置于150mL具塞錐形瓶中，預熱后加入一定量固定化酶，在溫度50℃、轉(zhuǎn)速200r/min恒溫搖床中反應(yīng)50h，間隔取樣，用薄層色譜法檢測，計算各糖組分的含量。1.3.4糖組分的測定采用上行的薄層色譜法，以硅膠G作薄板，正丙醇∶水=85∶15為展開劑，點樣量為0.2μg/μL，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液為顯色劑，110℃加熱顯色10min，用直接測定法檢測各糖組分含量。2結(jié)果與討論2.1海藻酸鈉半童糖苷酶條件的選擇2.1.1海藻酸鈉濃度分別用濃度為2%、3%、4%、5%、6%海藻酸鈉固定化β-半乳糖苷酶，測定不同條件下的固定化酶活力，結(jié)果如圖1所示。固定化酶活力隨著海藻酸鈉濃度的增大而提高，當海藻酸鈉濃度達到4%時，固定化酶活力最高，之后酶活力略有下降。海藻酸鈉濃度低時，酶泄漏嚴重，清洗酶珠時，酶損失較多，酶活力下降；海藻酸鈉濃度高時，微環(huán)境效應(yīng)和擴散阻力對反應(yīng)影響更大，且不易操作，很難將酶液從注射器中擠出。故選用4%海藻酸鈉對酶進行固定化較為適宜。2.1.2海藻酸鈉4g添加戊二醛濃度對固定化酶活力的影響戊二醛作為一種雙功能交聯(lián)劑，可以使海藻酸鈉分子發(fā)生交聯(lián)，同時也能使酶交聯(lián)在載體上，能夠增強海藻酸鈉的機械強度和固定化酶的穩(wěn)定性。分別用濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%戊二醛溶液對制得的固定化酶珠進一步交聯(lián)，測定不同條件下固定化酶的活力。從圖2可以看出，戊二醛濃度為0.3%時，固定化酶相對酶活最高，低于0.3%時，固定化酶活力隨戊二醛濃度的增加而增大，但進一步增加戊二醛濃度會導致酶活力下降，這是因為酶分子活性基團被戊二醛過多修飾的結(jié)果，故適宜的戊二醛濃度為0.3%。2.1.3液態(tài)β-半乳糖苷酶的用量分別稱取海藻酸鈉4g加入液態(tài)β-半乳糖苷酶10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL進行固定化，測定不同條件下固定化酶的活力，結(jié)果如圖3所示。隨著加酶量的增加，表觀酶活不斷增大，而酶活力回收率不斷下降。加酶量為30mL時，表觀酶活和酶活力回收率均較高。酶活力回收率下降的原因可能是由于載體內(nèi)部阻力或載體的表面空間障礙阻礙酶分子的基因被修飾造成的。為了保證單位質(zhì)量固定化酶有較高的活力，而收率不致太低，考慮既經(jīng)濟可行又能使酶得到充分利用，選擇30mL加酶量為宜。2.2液體酶與固定化酶的穩(wěn)定2.2.1固定化酶的篩選取一定量固定化酶和游離酶于4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃溫度下保存2h，測定酶活力，結(jié)果如圖4所示。酶經(jīng)固定化后耐熱范圍變寬，在60℃保溫2h后，固定化酶活力為初始酶活的72%，而游離酶僅為初始酶活的19%。在20～70℃溫度下用固定化和游離酶β-半乳糖苷酶水解1mL5%乳糖5min，其結(jié)果見圖5。固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為55℃，與游離酶相同。這一反應(yīng)溫度不僅能提高反應(yīng)速度，同時又可防止外界微生物的污染，有利于酶在乳品工業(yè)中的應(yīng)用。2.2.2酶穩(wěn)定性測定取一定量的固定化酶和游離酶于pH為3、4、5、6、7、8、9下保存2h，測定酶活力，結(jié)果如圖6所示。游離酶的pH穩(wěn)定范圍是4～6，酶經(jīng)固定化以后pH穩(wěn)定范圍是4～7,pH穩(wěn)定性提高。在pH<4或pH>7時，固定化酶活力迅速下降，可能是過酸或過堿的環(huán)境使酶的活性中心部位基團發(fā)生了不可逆的變化。在pH3.0～9.0條件下用固定化和游離酶β-半乳糖苷酶水解1mL5%乳糖5min，其結(jié)果見圖7。酶固定化以后最佳反應(yīng)pH和游離酶相比沒有改變，均在pH6.0時酶活力最高。2.2.3游離酶將酶在4℃保存，每隔一周取樣測其酶活，結(jié)果固定化酶在放置8周后仍能保持80%以上的酶活，而游離酶2周后已經(jīng)降到40%以下。這與海藻酸鈣和戊二醛交聯(lián)使酶結(jié)構(gòu)牢固有關(guān)，因此用海藻酸酸鈣制備固定化酶，不僅具有較好的熱穩(wěn)定性，而且可以長期保存，為該酶在連續(xù)化生產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2.3低聚半乳糖的合成取適量的固定化酶，在溫度55℃、pH6.0、乳糖濃度40%時，研究了水相中酶法合成低聚半乳糖的反應(yīng)歷程，結(jié)果見圖8。隨著時間的延長，乳糖的轉(zhuǎn)化率呈上升的趨勢，低聚半乳糖合成率呈拋物線變化，葡萄糖和半乳糖的產(chǎn)率呈緩慢上升趨勢。在反應(yīng)時間為30h，乳糖轉(zhuǎn)化率為60%時，GOS的合成率達最大值36.37%,隨后GOS開始水解，合成率逐漸降低，說明GOS的合成存在著最適的酶反應(yīng)時間，反應(yīng)時間太短或太長都不利GOS的合成。3結(jié)論3.1固定化酶法用海藻酸鈣包埋、戊二醛進行交聯(lián)，對β-半乳糖苷酶固定化研究表明，該法簡便、酶的活力回收率較高、安全性好。當海藻酸鈉濃度為4%，戊二醛濃度為0.3%，加酶量為30mL時，固定化酶珠強度和活力最高。3.2最佳反應(yīng)溫度和ph值與游離酶相比，固定化β-半乳糖苷酶對熱、pH值耐受范圍較