原位多聚酶鏈反應(yīng)insiu的研究進(jìn)展

20世紀(jì)90年代，哈希首次報(bào)告了致死多聚酶鏈反應(yīng)（insitupcr）。該技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)PCR的高效擴(kuò)增和原位雜交的細(xì)胞定位的優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)PCR技術(shù)自Mullis等人發(fā)明以來,對(duì)分子生物學(xué)產(chǎn)生了深刻的影響,它提供了一種相當(dāng)有效的方法用于擴(kuò)增微量DNA或RNA至幾百萬倍用于測(cè)序、克隆和診斷等。但它不能反映擴(kuò)增產(chǎn)物和組織結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。原位雜交技術(shù)自Gall和Pardue首次報(bào)道以來,經(jīng)歷了許多變化,目前在動(dòng)植物及人類研究中發(fā)展很快。它能夠檢測(cè)細(xì)胞組織樣品中的DNA和RNA,從而揭示DNA或RNA序列與組織結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,但它需要相當(dāng)大量的DNA和RNA用于檢測(cè),低拷貝的DNA和RNA不能檢測(cè)到。因此,它在許多研究領(lǐng)域里受到限制。原位PCR成功地結(jié)合了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),能夠在組織切片、細(xì)胞等樣品中檢測(cè)到低拷貝至單個(gè)拷貝的DNA或RNA,并在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上準(zhǔn)確定位。通過揭示細(xì)胞內(nèi)低拷貝核酸的分布,可進(jìn)一步進(jìn)行病毒感染、基因突變、染色體易位、基因低水平表達(dá)和基因治療等研究。本文將介紹原位PCR的主要研究方案、基本步驟及其應(yīng)用。1利用細(xì)胞進(jìn)行原位檢測(cè)自從液相PCR發(fā)明以來,就有人試圖進(jìn)行原位PCR。1990年,Hasse等首次報(bào)道了一個(gè)成功的原位PCR試驗(yàn)。他們?cè)诨鞚嵋褐泄潭ㄍ暾募?xì)胞,通過酶消化來預(yù)處理核膜,從而允許引物、聚合酶、游離核苷酸進(jìn)入核膜內(nèi),通過帶有互補(bǔ)末端的多重引物來設(shè)法擴(kuò)大要擴(kuò)增信號(hào)的大小,利用細(xì)胞膜作為一個(gè)袋子保存擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增是在反應(yīng)管中進(jìn)行,其原理與液相PCR的擴(kuò)增原理基本相同。反應(yīng)結(jié)束后,將細(xì)胞離心沉淀在載玻片上,再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行原位檢測(cè)。自那以后,許多實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道成功地進(jìn)行過原位PCR。其基本原理與原方案相符,但大多對(duì)原型作了不同程度的改進(jìn)。研究對(duì)象從完整細(xì)胞懸液發(fā)展為細(xì)胞涂片、細(xì)胞離心標(biāo)本、冰凍切片和石蠟切片、中期染色體標(biāo)本等。研究方案亦在不斷改進(jìn),總體上有以下幾種。1.1pcr擴(kuò)增結(jié)果不同直接原位PCR是使用標(biāo)記的引物或游離核苷酸進(jìn)行原位PCR反應(yīng),這種標(biāo)記分子隨后進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物中,擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察而不需要進(jìn)行原位雜交(圖1)。直接原位PCR具有操作簡(jiǎn)便、流程短、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已有不少成功的報(bào)道。但直接原位PCR易發(fā)生引物錯(cuò)配或非特異性退火,容易出現(xiàn)假陽性;此外,標(biāo)記的引物還會(huì)降低PCR效率。因而它尚需進(jìn)一步改進(jìn),才能成為更加可靠的方法。1.2原位雜交再檢測(cè)間接原位PCR是在沒有標(biāo)記物的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,再用原位雜交技術(shù)來檢測(cè)擴(kuò)增的信號(hào)(圖1)。該方法可以克服由于DNA修復(fù)或引物錯(cuò)配引起的非特異性問題,成為目前最廣泛使用的方案。該方法需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的洗脫和原位雜交過程,因而所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。1.3rewelltranscrapt-pcr檢測(cè)mrna表達(dá)在原位PCR中加上一步反轉(zhuǎn)錄過程(RT),新形成的cDNA作為模板用于擴(kuò)增,這個(gè)過程叫做原位反轉(zhuǎn)錄PCR(insitureversetranscriptionPCR,簡(jiǎn)稱原位RT-PCR)。它又分為直接原位RT-PCR和間接原位RT-PCR兩種(圖2)。該方法可用來檢測(cè)細(xì)胞或組織中低拷貝的mRNA或特異基因的表達(dá)在原位中首先要對(duì)組織樣品進(jìn)行DNA酶處理,以破壞組織細(xì)胞中的DNA。1991年,Cetus公司推出了一種新酶,可以同時(shí)執(zhí)行RT和PCR反應(yīng),從而減少了反應(yīng)時(shí)間。1.4進(jìn)行3r反應(yīng)Zebe等1994年率先提出了原位再生式復(fù)制反應(yīng)(Self-sustainedsequencereplicationreaction,簡(jiǎn)稱3SR反應(yīng))。它可作為原位RT-PCR的一種選擇方法用于完整的細(xì)胞和組織切片中低拷貝數(shù)mRNA的檢測(cè)。它還特別有利于與免疫組織化學(xué)相結(jié)合。2原pcr的主要步驟原位PCR整個(gè)過程相當(dāng)復(fù)雜,而且技術(shù)要求高。這項(xiàng)技術(shù)還在它的完善階段正經(jīng)歷許多發(fā)展它的成功取決于適當(dāng)操作和被證實(shí)的特異對(duì)照。下2.1原位pcr固定原位PCR可以在細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、細(xì)胞離心標(biāo)本、石蠟切片及冰凍切片上進(jìn)行。相比之下,以懸浮的完整細(xì)胞做原位PCR效果最好,細(xì)胞涂片和細(xì)胞離心標(biāo)本次之,而切片標(biāo)本最差。原位PCR最理想的固定方法應(yīng)該既能保護(hù)DNA或RNA,又能保護(hù)組織的形態(tài)。常用的固定劑,緩沖福爾馬林(10%,4℃固定4-6h)和4%的多聚甲醛,一般都能滿足這一要求。Greer等用經(jīng)固定的石蠟包埋組織做PCR,檢查了11種固定劑、3種固定時(shí)間對(duì)PCR的影響。他們的結(jié)果可為原位PCR組織固定法的選擇提供參考2.2污染條件對(duì)pcr的影響在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前,一般都要用蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理。組織標(biāo)本經(jīng)蛋白酶消化后,能增加透性,允許試劑進(jìn)入,并暴露靶序列用以擴(kuò)增。酶的濃度、處理時(shí)間和溫度很重要。過渡消化會(huì)扭曲組織形態(tài),使得PCR產(chǎn)物從破壞的細(xì)胞膜內(nèi)擴(kuò)散出來;如果消化不夠,組織將會(huì)有較差的滲透度以及蛋白質(zhì)和核苷酸的交聯(lián)過度,會(huì)影響PCR反應(yīng)。這些都會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。消化的強(qiáng)度還應(yīng)與組織的固定程度相適應(yīng)組織樣品固定越深消化也要越強(qiáng)些消化后酶要通過加熱去活化或洗脫完全除去。2.3原位pcr方法原位PCR非特異性或假陽性的產(chǎn)生在很大程度上來源于引物與模板的錯(cuò)配。因此,設(shè)計(jì)一對(duì)和組織中其他序列很少或沒有同源性的引物是十分重要的?，F(xiàn)在已有一些計(jì)算機(jī)程序用于證實(shí)所設(shè)計(jì)的引物的同源性。引物通常含18-28個(gè)核苷酸,對(duì)于保存在石蠟切片中的組織樣品,適合用較短的引物,有時(shí)為提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,可以采用2對(duì)或多對(duì)引物。原位PCR和液相PCR的擴(kuò)增原理基本相同,但由于原位PCR在固定的細(xì)胞、組織標(biāo)本上進(jìn)行,因而又有其特殊性。原位PCR中,靶序列DNA或RNA是不移動(dòng)的,由于空間位置的緣故,不是所有的靶序列都可以與引物結(jié)合而獲得擴(kuò)增。一般認(rèn)為原位PCR效率低于傳統(tǒng)PCR。為獲得較好的擴(kuò)增效率,引物和DNA聚合酶的濃度比傳統(tǒng)PCR要高一些,每一個(gè)保溫時(shí)間都相應(yīng)地稍長(zhǎng)一些。對(duì)于細(xì)胞涂片、細(xì)胞離心標(biāo)本或組織切片標(biāo)本,擴(kuò)增在玻璃載玻片上進(jìn)行。載玻片原位PCR的熱循環(huán)可在專用的熱循環(huán)儀進(jìn)行,用鋁箔紙鋪在常規(guī)PCR熱循環(huán)儀平臺(tái)上形成一個(gè)平板,也可以進(jìn)行原位PCR。為獲得足夠的產(chǎn)物用于檢測(cè),一般需要20～40次循環(huán)。為提高PCR的特異性,一種“熱啟動(dòng)”技術(shù)已發(fā)展起來。熱啟動(dòng)最先是在載玻片已經(jīng)加熱94℃幾分鐘后,加入DNA聚合酶?，F(xiàn)在應(yīng)用“熱啟動(dòng)”方法中,有許多改進(jìn)。一種Ampliwax的特殊蠟被用在80℃以下隔開反應(yīng)混合物和聚合酶;另有一種單克隆抗體能夠在70℃以下特異有效阻止TaqDNA聚合酶的活性,在熱循環(huán)的第一次變性步驟中,由于抗體加熱去活化,從而除去它對(duì)TaqDNA聚合酶的抑制作用。原位PCR成功的一個(gè)重要因素是產(chǎn)物的保留。大量產(chǎn)物保留在原位的原因還不完全清楚。細(xì)胞膜和核膜可能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的保留起重要作用;擴(kuò)增產(chǎn)生的一些長(zhǎng)的產(chǎn)物也可能作為一種“錨”而有效地保留一些擴(kuò)增產(chǎn)物;帶有更多組織結(jié)構(gòu)的厚切片可能有助于將擴(kuò)增產(chǎn)物保持在原位。此外,密封的蓋玻片或塑料袋也可用來阻止蒸發(fā),將產(chǎn)物保持在原位。PCR后處理,如60℃干燥或固定于2%～4%聚甲醛中也是一種有效的固定擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。2.5洗滌劑不充分原位擴(kuò)增結(jié)束后,標(biāo)本要輕輕地洗滌,以除去彌散到細(xì)胞以外的擴(kuò)增產(chǎn)物。洗滌不充分,會(huì)使彌散的擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)顯現(xiàn),造成背景過高或假陽性結(jié)果,而過分的洗滌可能會(huì)從起始位置除去擴(kuò)增產(chǎn)物。因此,洗滌的程度要折衷于減低背景和保留強(qiáng)陽性信號(hào)這兩個(gè)因素。2.6pcr前雜交間接原位PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是通過原位雜交來檢測(cè)的。雜交前通常要進(jìn)行預(yù)雜交。預(yù)雜交也可在PCR前進(jìn)行,這種修改能減少洗脫的步驟和次數(shù),同時(shí)有利于保存擴(kuò)增產(chǎn)物。原位雜交的方法很多最直接的方法是采用標(biāo)記有生物素或地高辛的寡聚核苷酸探針,在甲酰胺存在下,溫度37℃～54℃及適當(dāng)條件下雜交3小時(shí)或過夜。此外,還有放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等多種檢測(cè)方法。2.7原位pcr檢測(cè)dna和rna原位PCR是一種敏感性很高的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA序列的新技術(shù),其整個(gè)流程相當(dāng)復(fù)雜。不適當(dāng)?shù)墓潭ê皖A(yù)處理、不適當(dāng)?shù)囊?、缺損DNA的修復(fù)以及產(chǎn)物的擴(kuò)散等都將會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到正確、合理的解釋,必須設(shè)置一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)。理論上每次實(shí)驗(yàn)需要有20多個(gè)對(duì)照,在實(shí)際操作中,為保證反應(yīng)的特異性,以下對(duì)照要首先考慮。(1)同時(shí)擴(kuò)增一個(gè)已知陽性和陰性的樣品中的靶序列作為對(duì)照。該對(duì)照樣品最好是與待測(cè)樣品相似的組織或細(xì)胞。(2)從同一樣品中提取DNA或RNA,在載玻片上作液相PCR或RT-PCR。(3)將數(shù)量已知的不含靶序列的無關(guān)細(xì)胞與含有靶序列的細(xì)胞混合或在同一組織中設(shè)置相鄰的陽性和陰性,用以區(qū)別由于擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散而造成的假信號(hào)。(4)省去TaqDNA聚合酶進(jìn)行原位擴(kuò)增作一個(gè)陰性對(duì)照。(5)省去引物或用無關(guān)引物代替特異性引物進(jìn)行原位擴(kuò)增作為一個(gè)陰性對(duì)照,用作檢測(cè)DNA聚合酶作用下的缺損DNA修復(fù)的對(duì)照。(6)原位擴(kuò)增之前用DNA酶或RNA酶預(yù)處理待檢測(cè)標(biāo)本作為一個(gè)陰性對(duì)照。(7)省去探針或省去標(biāo)記的引物作為檢測(cè)體系的對(duì)照。3低小分子分析技術(shù)原位PCR技術(shù)是一種將PCR技術(shù)的高度敏感、高效擴(kuò)增的特點(diǎn)與分子雜交方法精細(xì)定位的特點(diǎn)緊密結(jié)合在一起發(fā)展起來的分子分析技術(shù)。它在原位檢測(cè)低拷貝基因及基因低水平的表達(dá)方面有著其獨(dú)特的優(yōu)越性。這一技術(shù)從建立以來就受到國(guó)外有關(guān)研究領(lǐng)域許多學(xué)者的重視,近年來,國(guó)內(nèi)亦有了少數(shù)報(bào)道。目前原位PCR主要應(yīng)用在三個(gè)領(lǐng)域:外源基因檢測(cè),基因變異的鑒定和基因表達(dá)研究。3.1外源基因檢測(cè)3.1.1原位rt-pcr檢測(cè)aids系統(tǒng)的細(xì)胞系統(tǒng)許多疾病是由于細(xì)菌真菌病毒等感染而引起的。應(yīng)用原位PCR對(duì)艾滋病毒(humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV)進(jìn)行研究,導(dǎo)致了許多重大發(fā)現(xiàn)。Bagasra等人[12—14]用間接原位PCR分析了11個(gè)HIV血清陽性病人的外周血大單核細(xì)胞的感染情況。其中8個(gè)病人被發(fā)現(xiàn)含有HIVDNA序列,而這8例用傳統(tǒng)的原位雜交方法未能檢測(cè)出來。繼而他們還分析了56個(gè)HIV血清學(xué)陽性和11個(gè)血清學(xué)陰性病人的外周血大單核細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)血清學(xué)陽性患者有0.1～13.5%細(xì)胞攜帶有HIV基因組序列,而且病毒的強(qiáng)弱還與疾病時(shí)期有關(guān);血清陰性的病人大單核細(xì)胞無一例有陽性信號(hào)。其中的42例CD4T淋巴細(xì)胞有HIV感染的占0.2%到69%。隨著陽性率的增高,病情也在進(jìn)展。Nuovo等用直接原位PCR對(duì)外周血細(xì)胞進(jìn)行了研究,也觀察到同樣的結(jié)果。他們?cè)谒芯康?0個(gè)AIDS病人的外周白細(xì)胞中檢測(cè)到HIV-1DNA,陽性細(xì)胞占周圍淋巴細(xì)胞的1.8～6.2%。Patterson等在可能有HIV感染的病人血細(xì)胞中進(jìn)行原位RT-PCR。擴(kuò)增信號(hào)和熒光標(biāo)記的探針雜交,然后通過流式細(xì)胞光度術(shù)將細(xì)胞分成HIV陽性和陰性細(xì)胞。對(duì)前病毒DNA和mRNA分析顯示,HIV基因存在于大量的潛伏感染細(xì)胞群中。原位PCR還可以從經(jīng)母親感染的18個(gè)月前的嬰兒體內(nèi),在其他方法檢查血清成陽性反應(yīng)之前檢測(cè)出艾滋病毒。Embretson等對(duì)HIV序列作原位PCR用以檢查艾滋病病人的淋巴結(jié)中的CD4淋巴細(xì)胞。從感染早期到晚期,整個(gè)淋巴系統(tǒng)中有非常大量的潛伏感染的CD4淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞含有HIV病毒;HIV和樹狀濾泡細(xì)胞之間的亞細(xì)胞之間的聯(lián)系也已被證實(shí)。當(dāng)這些細(xì)胞通過淋巴小囊移動(dòng)時(shí)可能將會(huì)感染其它細(xì)胞。Zevallos等對(duì)艾滋病病人的胎盤進(jìn)行了研究。其結(jié)果提供了認(rèn)識(shí)HIV垂直傳染的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。以上研究為HIV的研究展現(xiàn)了一幅新圖像,艾滋病毒的復(fù)雜致病機(jī)理將被逐步揭示。Zehbe等應(yīng)用原位自我再生式序列復(fù)制反應(yīng)(3SR)技術(shù)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞系中單拷貝人類乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)的游離基因進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:常規(guī)原位分子雜交只能顯示很弱的癌細(xì)胞漿中HPV16E6mRNA信號(hào),經(jīng)過3SR擴(kuò)增后,胞漿內(nèi)可見到很強(qiáng)的陽性信號(hào)。運(yùn)用原位PCR和原位RT-PCR還研究了許多保存的組織樣品和細(xì)胞系中的其它病毒感染和細(xì)菌感染。包括乙肝病毒,丙肝病毒,單純皰疹病毒,麻疹病毒,脊髓前角灰質(zhì)炎病毒和結(jié)核桿菌等。利用原位對(duì)這些病毒的檢測(cè)既提高了敏感性也達(dá)到了組織細(xì)胞定位的目的。3.1.2外源基因的檢測(cè)隨著分子生物學(xué)和基因工程的迅速發(fā)展,越來越多的人從事轉(zhuǎn)基因研究,在動(dòng)、植物轉(zhuǎn)基因方面已有不少成功的例子,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成功的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的人的基因治療正顯示著美好的發(fā)展前景。對(duì)導(dǎo)入基因進(jìn)行檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因研究中是極端重要而又必不可少的。Southern印跡、PCR、原位分子雜交是檢測(cè)外源基因的傳統(tǒng)手段,新發(fā)展起來的原位PCR在檢測(cè)外源基因方面特別有用。Yin等對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)入的外源基因進(jìn)行研究。他們以缺陷單純皰疹病毒為載體,向腦內(nèi)導(dǎo)入功能基因—前腦啡肽原啟動(dòng)子,觀察動(dòng)情素。在每個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中,用原位PCR都可以在腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞中顯示1個(gè)拷貝的DNA,而常規(guī)原位分子雜交則不能。該方法對(duì)導(dǎo)入基因本身進(jìn)行檢測(cè),能追蹤和定出轉(zhuǎn)入基因的確切位置,從而很好地克服了目前采用的標(biāo)記基因的缺陷。因?yàn)閷?dǎo)入的基因并不一定能表達(dá),也不一定能轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)和發(fā)揮功能作用。因此,可預(yù)料原位PCR檢測(cè)將在研究導(dǎo)入基因的遺傳穩(wěn)定性、基因工程應(yīng)用以及基因治療等方面有著重大的意義。3.2原位反轉(zhuǎn)錄pcr檢測(cè)生物體具有遺傳和變異的特性,當(dāng)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境改變時(shí),有的基因會(huì)發(fā)生改變,隨之也可能發(fā)生相應(yīng)的功能改變。原位PCR能用于基因突變、基因重組和染色體易位等基因變異研究。Embleton等用原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)顯示了擴(kuò)增拼接重排的免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(qū)基因。Long等對(duì)一個(gè)人鼠雜交瘤細(xì)胞系Con進(jìn)行了研究。該雜交瘤細(xì)胞中有一穩(wěn)定的染色體14及18易位。利用一對(duì)特異性引物分別進(jìn)行PCR、原位雜交及原位PCR。結(jié)果證明,原位PCR是檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中低拷貝DNA最有效的方法。Tokusashi等運(yùn)用原位PCR技術(shù)區(qū)分鼠肝組織切片中正常的清蛋白基因和發(fā)生突變的清蛋白基因。此外,應(yīng)用此技術(shù)還可鑒定一些單個(gè)細(xì)胞種類獲得或遺傳的特定DNA序列改變。3.3原位rt-pcr和新體對(duì)克氏原螯蝦mrna的定位表達(dá)原位RT-PCR技術(shù)能夠反轉(zhuǎn)錄mRNA到cDNA,然后原位擴(kuò)增cDNA來檢測(cè)mRNA的表達(dá)。它可用于檢測(cè)固有內(nèi)源性基因表達(dá)和導(dǎo)入的外源基因表達(dá)兩方面。其定位水平從組織細(xì)胞水平逐漸發(fā)展到了亞細(xì)胞水平和染色體上等對(duì)不同組織細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的mRNA,用原位反轉(zhuǎn)錄PCR的方法,以對(duì)特異性序列為引物進(jìn)行檢測(cè)。EGFR在分