應(yīng)用光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)肌紅蛋白

肌肉紅蛋白（m）是存在于人體和動(dòng)物肌肉和骨瘦如肌肉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，占肌肉總蛋白的2%。它由氨基酸和血紅素的輔助化合物組成。相對(duì)分子量約為178080。它具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣的功能。這是早期觀察到的肌肉損害的高度敏感因素。心肌損傷后血中Mb濃度的升高早于心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白等其他標(biāo)志物,對(duì)血清Mb的檢測(cè)有助于早期快速診斷各種心肌損傷,進(jìn)而有助于患者得到早期治療。我們采用光激化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(lightinducedchemiluminescentimmunoassay,LICI)建立一種定量檢測(cè)血清Mb的方法,并對(duì)檢測(cè)性能進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。材料和方法一、長(zhǎng)臂活化生物素Mb純品、發(fā)光微粒、包被有鏈霉親合素的感光微粒以及Mb單克隆抗體均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并提供;長(zhǎng)臂活化生物素(NHS-LC-Biotin,美國(guó)Pierce公司);白色不透明微孔板(美國(guó)Packard公司);化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(美國(guó)Thermolabsystems公司)。二、方法1.混合標(biāo)準(zhǔn)品及校準(zhǔn)品用樣品稀釋液(0.02mol/LPBS,5g/LBSA,0.15mol/LNaCl,pH值7.4)稀釋Mb純品,配制1524.0、910.0、506.0、157.0、28.0、0ng/ml的系列校準(zhǔn)品。2.gb、s1d2株抗Mb不同表位的單克隆抗體分別命名為G3B和E2D。參考文獻(xiàn)的方法,將G3B抗體共價(jià)結(jié)合于發(fā)光微粒,將E2D抗體與NHS-LC-Biotin連接,進(jìn)行生物素化。3.mb濃度的測(cè)定將生物素化的E2D抗體(10μg/ml)與G3B抗體包被的發(fā)光微粒(1.2mg/ml)等量混合,每孔中加入26μl,再加入校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品15μl并充分混勻,37℃孵育15min,然后加入包被有鏈霉親合素的感光微粒(100μg/ml)100μl,37℃孵育15min后,在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)光信號(hào),根據(jù)光信號(hào)的強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)樣品中Mb的濃度。4.評(píng)價(jià)檢測(cè)到的性能包括分析靈敏度、線性、精密度、干擾試驗(yàn)以及方法學(xué)比較。三、統(tǒng)計(jì)方法用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均數(shù)(xˉxˉ)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)、變異系數(shù)(CV)的分析,采用直線回歸分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果一、標(biāo)準(zhǔn)曲線及分析靈敏度不含Mb的樣品稀釋液重復(fù)測(cè)定20次,計(jì)算xˉxˉ和s,參考文獻(xiàn),分析靈敏度是指能與“0”值校準(zhǔn)品相區(qū)別的最低分析物濃度,本方法取99.7%分布可能性的限值,以xˉ+3sxˉ+3s對(duì)應(yīng)的Mb濃度作為分析靈敏度。檢測(cè)結(jié)果xˉxˉ為1.2ng/ml,s為0.053ng/ml,本法的分析靈敏度為1.36ng/ml。二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用樣品稀釋液對(duì)高濃度的Mb血清樣品(1690ng/ml)進(jìn)行不同比例的稀釋(90%、50%、30%、20%、10%、2%),根據(jù)稀釋比例計(jì)算出各濃度樣品的預(yù)期值,樣品按照隨機(jī)次序進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度的樣品重復(fù)測(cè)定4次,將各濃度測(cè)定值的xˉxˉ與預(yù)期值進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)線性,見(jiàn)圖1。在33.8～1521.0ng/ml的范圍內(nèi)線性良好。三、檢測(cè)方法用樣品稀釋液系列稀釋Mb純品,配制3個(gè)濃度的檢測(cè)樣品,分別為27、155、906ng/ml,分裝后-20℃凍存。每個(gè)濃度的樣品分別連續(xù)測(cè)定20次,計(jì)算各濃度批內(nèi)的xˉxˉ、s以及CV;每個(gè)濃度每天測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定20d,計(jì)算各濃度日間的xˉxˉ、s以及CV,見(jiàn)表1。四、干擾率的測(cè)定在Mb濃度為155ng/ml的新鮮混合血清樣品中分別加入高濃度的血紅蛋白(Hb)、總膽紅素(TBil)、三酰甘油(TG),獲得干擾樣品,用同樣的方法加入樣品稀釋液作為對(duì)照樣品,每個(gè)樣品按照隨機(jī)次序測(cè)定10次,取干擾樣品和對(duì)照樣品各自測(cè)定值的xˉxˉ計(jì)算干擾率。Hb濃度為2.6g/L時(shí),干擾率為-9.61%;TBil濃度為342μmol/L時(shí),干擾率為-4.56%;TG濃度為11.3mmol/L時(shí),干擾率為7.47%。按照文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為干擾率>10%才有臨床意義。因此在溶血(Hb<2.6g/L)、黃疸(TBil<342μmol/L)、脂血(TG<11.3mmol/L)時(shí),對(duì)本檢測(cè)方法的干擾無(wú)臨床意義。五、電化學(xué)分光光度法與lici法檢測(cè)結(jié)果比較收集新鮮臨床血清樣品47份(Mb濃度范圍21.18～1399ng/ml),以RocheElecsys電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法(X)作為比較方法,與LICI法(Y)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),二者差異無(wú)顯著性(t=0.418,P=0.678)。對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析,表明2種方法的相關(guān)性很好,見(jiàn)圖2。lici檢測(cè)的應(yīng)用血清Mb用于臨床診斷急性心肌梗死最早可以追溯到1975年,雖然其心肌特異性不高,卻具有高度的敏感性,在心肌細(xì)胞發(fā)生壞死后0.5～1h,血液中Mb的濃度就會(huì)升高,并維持高水平5～12h,血清Mb的檢測(cè)特別有助于排除急性心肌梗死的診斷。由于血中Mb能被腎臟迅速清除,所以測(cè)定Mb也有助于觀察急性心肌梗死病程中有無(wú)再梗死發(fā)生以及梗死有無(wú)擴(kuò)展,同時(shí)Mb也是急性心肌梗死溶栓治療中評(píng)價(jià)有否再灌注的較為敏感和準(zhǔn)確的指標(biāo)。LICI是一種通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)微粒間的結(jié)合,進(jìn)而檢測(cè)分析物含量的方法。在680nm的光照下,感光微粒中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧,單線態(tài)氧擴(kuò)散至發(fā)光微粒,與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng),即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短(約4μs),只有那些通過(guò)待測(cè)物連接在一起的發(fā)光微粒和感光微粒才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。因此,LICI是均相免疫測(cè)定法,避免了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫法(RIA)等檢測(cè)方法中繁瑣的分離和洗滌步驟。同時(shí),由于微粒表面積的增加,也提高了檢測(cè)的靈敏度。我們采用LICI檢測(cè)血清Mb,其分析靈敏度可達(dá)1.36ng/ml,遠(yuǎn)低于RocheElecsys法的21ng/ml。通過(guò)對(duì)3個(gè)濃度樣品的檢測(cè),本法的批內(nèi)CV<5%,日間CV<7%,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似,基本符合臨床要求。與國(guó)外試劑(RocheElecsysMb)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí),二者差異無(wú)顯著性(P>0.05),但個(gè)別樣品,2種方法的測(cè)定結(jié)果仍有較大差異,這種現(xiàn)象在文獻(xiàn)中也有報(bào)道,可能與方法各自使用的單克隆抗體不同以及目前仍然沒(méi)有統(tǒng)一的Mb參考品和參考檢測(cè)方法有關(guān)