第七章基因的表達與調控（上）——原核基因表達調控模式1.原核基因表達調控總論2.乳糖操縱子與負控誘導系統3.色氨酸操縱子與負控阻遏系統4.轉錄水平的其他調控方式5.轉錄后調控主要內容7.1原核基因表達調控總論□基因表達（geneexpression）：從DNA到蛋白質或功能RNA的過程□基因表達調控（generegulation或genecontrol）對基因表達過程的調節(jié)□基因表達調控主要表現在兩個方面：轉錄水平的調控（transcriptionalregulation）轉錄后水平的調控（past-transcriptionalregulation）

1）mRNA加工成熟水平上的調控（differentialprocessingofRNAtrscript）

2）翻譯水平上的調控□原核生物中，營養(yǎng)狀況（nutritionalstatus）和環(huán)境因素（enviromental

factor）對基因表達起著舉足輕重的影響；在真核生物中特別是高等真核生物

激素水平（hormonelevel）和發(fā)育階段（developmentalstage）是基因表達調控的最主要的手段。7.1.1原核基因調控分類□負轉錄調控（negativetranscriptionregulation）調解基因的產物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結構基因轉錄的作用根據其特征又分為：1）負控誘導：阻遏蛋白（活性）不與效應物（誘導物）結合時，結構基因不轉錄。2）負控阻遏：阻遏蛋白（非活性）與效應物結合時（阻遏蛋白轉變?yōu)榛钚誀顟B(tài)）結構基因不轉錄?！跽D錄調控（positivetranscriptionregulation）調解基因的產物是激活蛋白（activator）1）正控誘導系統：誘導物的存在使激活蛋白處于活化狀態(tài)2）正控阻遏系統：效應物的存在使激活蛋白處于非活化狀態(tài)負控誘導系統正控誘導系統負控阻遏系統正控阻遏系統7.1.2原核基因調控的主要特點1.可誘導調節(jié)指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質的誘導下使基因活化。例子：大腸桿菌的lac操縱子可誘導基因；可誘導酶；酶的誘導合成2.可阻遏調節(jié)這類基因平時都是開啟的，處在產生蛋白質或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達。例子：大腸桿菌的Trp操縱子可阻遏基因；可阻遏酶；可阻遏現象；阻遏物□一般規(guī)律：可誘導的操縱子總是一些編碼糖和AA分解代謝蛋白的基因，這些操縱子常常是關閉的；可阻遏基因正好相反，他們是一些合成各種細胞代謝過程中所必需的小分子物質的基因，這些基因常常是打開的。7.1.3弱化子對基因活性的影響在這種調節(jié)方式中，起信號作用的是有特殊負載的AA-tRNA的濃度，是轉錄調節(jié)中的微調整。當操縱子被阻遏，RNA合成被終止時，起終止轉錄信號作用的那一段核苷酸被稱為弱化子。例子：Trp操縱子的弱化作用7.1.4降解物對基因活性的調節(jié)在葡萄糖存在的情況下，即使在細菌培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖等誘導物，與其對應的操縱子也不會啟動，不會產生出代謝這些糖的酶，這種現象稱為葡萄糖效應或降解物抑制效應。降解物抑制作用是通過提高轉錄強度來調節(jié)基因表達的。7.1.5細菌的應急反應應急反應的信號：ppGpp和pppGpp。產生這兩種物質的誘導物是空載tRNA。7.2乳糖操縱子與負控誘導系統□操縱子模型操縱子：基因表達的協同單位。指原核生物中由一個或多個相關基因以及轉錄翻譯調控元件組成的基因表達單元。操縱子學說：關于原核基因結構及其表達調控的學說□法國巴斯德研究所Jacob和Monod在1961年提出□操縱子的組成1）結構基因2）調節(jié)基因（I）3）控制部位：可接受調節(jié)基因產物的調節(jié)。包括啟動子（P區(qū)）和操縱基因（O區(qū)）。調節(jié)基因控制部位結構基因7.2.1乳糖操縱子模型1）Z、Y、A基因的產物由同一條多順販子的mRNA分子所編碼

Z基因：編碼β-半乳糖苷酶

Y基因：編碼β-半乳糖苷透過酶

A基因：編碼β-半乳糖乙酰基轉移酶2）該mRNA分子的啟動區(qū)（P）位于阻遏基因（I）與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨起始半乳糖苷酶和透過酶的高效表達3）操縱區(qū)（O）是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。4）當阻遏物與操縱區(qū)結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。5）誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱區(qū)結合，從而激發(fā)lacmRNA的合成□這一模型僅解釋了lac體系的負控系統，在lac操縱子同樣存在正調控！β-半乳糖苷酶透過酶乙?；D移酶7.2.2lac操縱子的影響因子1.lac操縱子的本底水平表達□問題：1）誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而轉運誘導物需要透過酶，透過酶的合成又需要誘導。

第一個誘導物是如何到達細胞的？2）乳糖（G-1,4-gal）并不與阻遏物結合，真正的誘導物是異乳糖（G-1,6-gal

）而異乳糖是在β-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。

乳糖誘導β-半乳糖苷酶的合成需要β-半乳糖苷酶的預先存在！□對這一現象的解釋：在非誘導狀態(tài)下有少量的lacmRNA合成（大約每個世代中有1-5個mRNA分子）這種合成被稱為本底水平的永久型合成□研究誘導作用時很少適用乳糖，而用乳糖類似物1）異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）2）巰甲基半乳糖苷（TMG）3）在酶活性分析中，常用顯色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）□他們都是高效誘導物，但不是半乳糖苷酶的底物，因此稱為安慰性誘導物2.大腸桿菌對乳糖的反應本底水平表達（幾個分子的β-半乳糖苷酶和透過酶）↓乳糖在透過酶作用下，lac進入細胞，又在β-半乳糖苷酶作用下乳糖轉變?yōu)?/p>

異乳糖↓異乳糖與結合在操縱區(qū)上的阻遏物結合導致

阻遏物失活↓lacmRNA開始合成3.阻遏物lacI基因產物及功能□lacI基因產物為阻遏蛋白，由4個相同亞基，每個亞基均含有347AA，并能與1分子IPTG結合?！鮨ac阻遏物mRNA是在弱啟動子控制下永久合成的。□當I基因由弱啟動子突變成強啟動子，細胞內不能產生足夠的誘導物來克服阻遏狀態(tài)，整個lac操縱子在這些突變體中不可誘導。4.葡萄糖對lac操縱子的影響β-半乳糖苷酶lac——————→G+galgal操縱子G□將G和lac同時加入培養(yǎng)基，大腸桿菌在耗盡外源G之前不會誘發(fā)lac操縱子□G對lac操縱子表達的抑制是間接的證據：一個大腸桿菌突變株，他在EMP途徑中不能將G-6-P轉化為下一步代謝中間物，這些細菌的lac基因能在葡萄糖存在時被誘導合成?！醮x物阻遏效應（葡萄糖效應）葡萄糖的某些降解產物（不是葡萄糖）抑制lacmRNA合成的現象G耗盡（或：有葡萄糖存在時，不論誘導物存在與否，操縱子都沒有轉錄活性，結構基因都不表達）5.cAMP與代謝物激活蛋白（lac操縱子的正調節(jié)）□在大腸桿菌中，cAMP的濃度受G代謝的調節(jié)1）將細菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中，細胞內cAMP濃度就高；2）如果在含G培養(yǎng)基中，細胞內cAMP濃度就低；3）如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進行EMP途徑（甘油其實可進入EMP途徑）的碳源，細胞內cAMP濃度也會很高。

說明：在EMP途徑中位于G-6-P與甘油之間的某些代謝產物是cAMP酶的抑制劑□大腸桿菌中的代謝物激活蛋白（CAP），或稱為cAMP-受體蛋白（CRP）,由Crp基因編碼，能與cAMP形成復合物cAMP-CRP?！魿rp和cAMP酶基因突變的細菌都不能合成lacmRNA

CRP和cAMP（兩者單獨不起作用）都是合成lacmRNA所必需的！□G會降低細胞內cAMP的水平。當G缺乏時，大腸桿菌細胞內cAMP上升，CRP結合到cAMP上。CRP-cAMP結合到緊鄰RNAPol結合位點上游的lac操縱子Plac上。CRP的結合引起DNA鏈發(fā)生90度彎曲，這增強RNAPol與啟動子的結合，使轉錄效率提高50倍?！跫毦鷮τ赾AMP-CRP復合物的需要是獨立的，與阻遏體系無關，轉錄必須有cAMP-CRP復合物結合在DNA的啟動子上，是lac操縱子的正調控因子□lac操縱子是在負調控和正調控兩個獨立的調控體系下完成的。正調控位點負調控位點lac操縱子必須同時在CRP結合位點結合cAMP-CRP和去阻遏狀態(tài)下才能高效表達7.2.3lac操縱子中的其他問題A基因及其生理功能

A基因：編碼β-半乳糖苷乙?；D移酶，使β-半乳糖第6位C原子乙?；瘑栴}：為什么A基因不在乳糖降解中起作用呢？自然界存在很多能被β-半乳糖苷酶降解的β-半乳糖苷分子，其分解產物不能被進一步代謝，很容易在體內積累，是細胞正常生長的抑制物。而β-半乳糖苷分子（如IPTG）被乙?；螅荒鼙沪?半乳糖苷酶降解。抑制有害物質的積累。證據：當有IPTG存在時，I-OcA-大腸桿菌的生長速度顯著慢于相應的A+

株系，其差異僅僅在于IPTG被乙酰化。2.Lac基因產物數量上的比較

在一個完全被誘導的細胞中

β-半乳糖酶：β-半乳糖透過酶：β-半乳糖苷乙酰基轉移酶=1：0.5：0.2不同酶在數量上的差異是由于翻譯水平上受到調節(jié)所致。1）大多數多順反子mRNA分子，存在一個從mRNA的5’端到3’端的蛋白質合成的梯度。當lacmRNA與核糖體脫離，終止蛋白質合成，其發(fā)生的頻率取決于AUG密碼子再度起始翻譯的概率?？拷黰RNA的5’端再度起始的概率大。2）在lacmRNA分子內部，A基因比Z基因更易受內切酶作用。3.操縱子的融合與基因工程操縱子在自然條件下可能發(fā)生融合如：lac操縱子與負責嘌呤合成的pur操縱子的偶聯。OPZpur基因POZYAtsxPOpur基因lac操縱子pur操縱子控制細胞對T6噬菌體敏感性基因tsxsZ細胞tsxRZ-突變體強啟動子缺失pur基因啟動子一部分缺失Z基因的終止序列融合基因7.3Trp操縱子與負控阻遏體系Trp的合成分5步完成，有7個基因參與整個合成過程7.3.1Trp操縱子的阻遏系統□由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受G或cAMP-CRP的調控?！醍斉囵B(yǎng)基中含有高濃度的trp時，Trp操縱子不表達；當培養(yǎng)基中trp不足時，Trp操縱子表達?！{節(jié)基因trpR的產物稱為輔阻遏蛋白，可與trp結合形成有活性的阻遏物與O區(qū)結合并關閉trpmRNA轉錄；缺乏trp時，輔阻遏蛋白失去trp并從O區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。7.3.2弱化子與前導肽有些現象與以阻遏作為唯一調節(jié)機制的觀點不一致1）在trp高濃度和低濃度下觀察到trp操縱子的表達水平相差600倍，而阻遏作用僅使轉錄降低70倍。2）使阻遏物失活突變不能完全消除trp對trp操縱子的影響?！@種調控機制與阻遏物的控制無關，必定有其他調控機制！□研究證實，阻遏-操縱機制控制轉錄的啟動，是trp操縱子的粗調開關，還有另外一個系統進行細調控并決定已經啟動的轉錄能否繼續(xù)下去?！趸饔谩跞趸饔茫菏峭ㄟ^轉錄到達第一個結構基因之前的過早終止來實現的□前導區(qū)：trpE基因的起始密碼前一個162bp的mRNA片段稱為前導區(qū)其中123-150位堿基序列缺失，trp基因表達可提高6-10倍。當mRNA合成起始后，除非培養(yǎng)基中完全沒有trp，轉錄總在這個區(qū)域終止，產生一個僅有140nt的RNA分子，終止trp基因轉錄。弱化子（attenuator）：指原核生物操縱子中能顯著減弱甚至終止轉錄作用的一段核苷酸序列。該序列能形成不同的二級結構，利用原核生物轉錄與翻譯的偶聯機制對轉錄進行調節(jié)?！踉搮^(qū)域mRNA通過自我配對可以形成莖-環(huán)結構，有典型終止子特點前導肽：前導序列包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，如果翻譯起始于AUG，應該產生一個14AA的多肽，這個假設的多肽稱為前導肽。mRNA前導區(qū)的序列分析□具有4個分別以1、2、3和4表示的片段，能以兩種不同的方式進行堿基配對。1）1-2，3-4配對：其中3-4配區(qū)正好位于終止密碼的識別區(qū)，為終止構型2）2-3配對：抗終止子結構4.轉錄的弱化作用□該理論認為，mRNA轉錄的終止是通過前導肽基因的翻譯來調節(jié)的。因為在前導肽基因中有兩個相鄰的trp密碼子（第10和11位），所以這個前導肽的翻譯必定對tRNATrp的濃度敏感。1）當培養(yǎng)基中[trp]低時，tRNATrp就少，翻譯通過兩個trp密碼子的速度就慢，當4區(qū)被轉錄完成時，核糖體才進行到1區(qū)（或停留在兩個trp密碼子處），此時前導區(qū)結構為2-3配對，不形成3-4配對的終止結構，轉錄繼續(xù)進行，直至將結構基因全部轉錄。2）當培養(yǎng)基中[trp]高時，tRNATrp就多，核糖體順利通過兩個trp密碼子，在4區(qū)被轉錄之前，核糖體就到達2區(qū)，形成形成3-4配對的終止結構，轉錄終止。弱化作用對RNAPol的影響依