冷凍保護劑種類對山羊卵母細胞發(fā)育效果的影響

山羊是重要的動物種類，也是山羊改良的理想模型。因此，山羊卵母細胞的冷凍保存對體外受刺激物、果核移植、轉(zhuǎn)化等相關(guān)技術(shù)應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價值。目前這方面的研究報道很少,冷凍效果很低。僅見郝志明等(1992)和LeGal(1996)采用程序冷凍法冷凍山羊GV期卵母細胞的兩篇報道,后者體外成熟率為23.7%,體外成熟卵母細胞的受精率為23.1%。本試驗從冷凍保護劑種類、冷凍方法、卵母細胞發(fā)育階段三方面對山羊卵母細胞發(fā)育能力的影響進行了研究。目的在于建立一套山羊卵母細胞適宜的冷凍程序,并為其它動物特別是珍稀瀕危動物的保種提供技術(shù)參考。1基礎(chǔ)液的表征卵母細胞成熟培養(yǎng)液、受精卵培養(yǎng)液、冷凍和解凍液的基礎(chǔ)液均為TCM199+25mmol/LHepes+2.2g/LNaHCO3+0.11g/L丙酮酸鈉+0.06g/L青霉素+0.1g/L鏈霉素。1.1實驗室37鹽水山羊卵巢采自成都市郊個體屠宰廠,山羊品種為成都麻羊,屠宰后立即置于37℃生理鹽水中,3h內(nèi)送至實驗室。用雙面刀片切割卵巢表面2~6mm卵泡,采卵液為PSB+5%NCS,選擇含2~3層致密卵丘細胞、形態(tài)正常的卵母細胞復(fù)合體,用于冷凍或成熟培養(yǎng)。1.2卵母細胞的培養(yǎng)卵母細胞成熟培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液+10μg/mlFSH+20μg/mlLH+1μg/ml17-βE2+10%NCS,微滴培養(yǎng),100μl微滴中培養(yǎng)10枚卵母細胞,在38.5℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度下培養(yǎng)24~26h(成熟培養(yǎng)9h冷凍的卵母細胞解凍后再培養(yǎng)15~17h)。1.3卵母細胞的外受精1.3.1精子獲能液制備采成都麻羊公羊鮮精,活力在0.7以上,用精子洗滌液(BO液+2.5mol/L咖啡因)200g,10min(2200r/min)離心2次后,加入2ml精子獲能液(BO液+10mg/mlBSA+20μg/ml肝素鈉+1μg/ml亞?；撬?,于38.5℃孵育30~60min。1.3.2受香精微滴將體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞(包括新鮮和冷凍的)放入50μl的受精液微滴中,每滴10~20枚。用獲能液調(diào)整精子濃度至2×106~6×106/ml精子,每滴受精液加入50μl獲能后的精子懸液,使精子終濃度為1×106~3×106/ml精子。1.3.3卵外培養(yǎng)精卵共同孵育8h后,將受精卵轉(zhuǎn)移至受精卵培養(yǎng)滴(基礎(chǔ)液+10%NCS),授精后20h觀察第二極體,48h觀察卵裂。1.4母細胞的冷凍和解凍1.4.1冷凍保護劑的使用冷凍液由基礎(chǔ)液+10%NCS+1.6mol/LPROH或1.6mol/LDMSO或1.6mol/L甘油組成。卵母細胞在冷凍液中室溫平衡21min,分3步進行,0.53mol/L、1.07mol/L、1.6mol/L冷凍保護劑的冷凍液中各平衡7min,然后分3段裝入0.25ml細管中,每管裝10~20枚卵母細胞,用聚乙烯醇粉末封口,然后將細管放入程序冷凍儀內(nèi)降溫,以1℃/min的速率從室溫降至-6℃,植冰,停留10min后,以0.3℃/min的速率降至-30℃,將細管投入液氮保存。將細管從液氮中取出,37℃10~20s水浴解凍,在室溫分3步去除保護劑,1.07mol/L、0.53mol/L、0mol/L保護劑各7min。1.4.2ops管生長特性將正常細管(0.25ml)拉至直徑和管壁厚度均為原來的一半,從中間割斷,制成OPS管。卵母細胞先在基礎(chǔ)液+20%NCS+10%EG+10%DMSO中平衡30~45s,然后用OPS管尖端接觸包含有卵母細胞的基礎(chǔ)液+20%NCS+20%EG+20%DMSO組成的微滴(1~2μl),卵子隨即被吸入,放入液氮,從卵子接觸高濃度的冷凍保護劑到浸入液氮,時間不超過25s。解凍時將OPS管從液氮中取出,OPS管尖端直接插入基礎(chǔ)液+20%NCS+0.25mol/L蔗糖中,卵子借助重力從管端流出,停留1min后,轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)液+20%NCS+0.15mol/L蔗糖中,停留5min,最后在基礎(chǔ)液中洗2次,每次5min。1.5形態(tài)正常的判定解凍后卵丘細胞未脫落,透明帶完整,胞質(zhì)均勻的卵母細胞,判為形態(tài)正常。冷凍的GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞以排出第一極體為成熟,冷凍的各發(fā)育階段(GV、9h、IVM)卵母細胞均以排出第二極體或見到雌雄原核為受精。1.6統(tǒng)計分析用方差分析進行數(shù)據(jù)處理,試驗重復(fù)3次以上。2結(jié)果與分析2.1proh和dmso對gv期卵母細胞的形態(tài)變化采用程序冷凍方法,冷凍山羊GV期和IVM卵母細胞,比較3種冷凍保護劑(PROH、DMSO、甘油)對解凍后卵母細胞發(fā)育效果的影響。結(jié)果見表1,表2。同一欄內(nèi)上標(biāo)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)。Differentsuperscriptswithinacolumnindicateasignificantdifference(P<0.05).Thesameasfollows.結(jié)果表明,對于GV期卵母細胞,從解凍后形態(tài)正常率來看,PROH和DMSO之間差異不顯著(P>0.05),但均高于甘油(P<0.05);而體外成熟率則是PROH高于DMSO和甘油,DMSO又高于甘油(P<0.05)。對于IVM卵母細胞,從解凍后形態(tài)正常率來看,PROH和DMSO之間差異不顯著(P>0.05),但均高于甘油(P<0.05);而從受精率來看,PROH高于DMSO和甘油,DMSO又高于甘油(P<0.05)。綜合分析,不論對于GV期和還是IVM卵母細胞,均是PROH優(yōu)于DMSO和甘油。2.2冷凍和ops玻璃化冷凍的gv期、培養(yǎng)9h和iiim卵母細胞的形態(tài)表征本試驗比較了山羊卵母細胞不同發(fā)育階段和冷凍方法對發(fā)育效果的影響,卵母細胞分為GV期、培養(yǎng)9h和IVM3個發(fā)育階段,冷凍方法分為程序冷凍和OPS玻璃化冷凍。程序冷凍所用保護劑為PROH,結(jié)果見表3。同一欄內(nèi)上標(biāo)字母不同者表示差異顯著(P<0.05);*對照組有8.3%卵母細胞發(fā)育至桑椹胚。Differentsuperscriptswithinacolumnindicateasignificantdifference(P<0.05).*8.3%oocytesofcontrolgroupdevelopedtomorula.結(jié)果表明,從冷凍方法看,程序冷凍和OPS玻璃化冷凍的GV期、培養(yǎng)9h和IVM卵母細胞的形態(tài)正常率差異均不顯著(P>0.05);而GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率和受精率,IVM卵母細胞的受精率和2-細胞率,均是OPS玻璃化冷凍高于程序冷凍,差異顯著(P<0.05)。從卵母細胞發(fā)育階段看,程序冷凍的GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率,GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的受精率差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于IVM卵母細胞(P<0.05),IVM卵母細胞2-細胞率為4.4%,而GV期和培養(yǎng)9h卵沒有進一步發(fā)育的;OPS玻璃化冷凍的結(jié)果與程序冷凍的相似,程序冷凍的GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率,GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的受精率差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于IVM卵母細胞(P<0.05),IVM卵母細胞2-細胞率為8.8%,而GV期和培養(yǎng)9h卵未見進一步發(fā)育。結(jié)果表明,從冷凍方法看,程序冷凍和OPS玻璃化冷凍的GV期、培養(yǎng)9h和IVM卵母細胞的形態(tài)正常率差異均不顯著(P>0.05);而GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率和受精率,IVM卵母細胞的受精率和2-細胞率,均是OPS玻璃化冷凍高于程序冷凍,差異顯著(P<0.05)。從卵母細胞發(fā)育階段看,程序冷凍的GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率,GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的受精率差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于IVM卵母細胞(P<0.05),IVM卵母細胞2-細胞率為4.4%,而GV期和培養(yǎng)9h卵沒有進一步發(fā)育的;OPS玻璃化冷凍的結(jié)果與程序冷凍的相似,程序冷凍的GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的成熟率,GV期和培養(yǎng)9h卵母細胞的受精率差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于IVM卵母細胞(P<0.05),IVM卵母細胞2-細胞率為8.8%,GV期和培養(yǎng)9h卵沒有進一步發(fā)育。3討論3.1不同冷凍牛體外成熟卵母細胞的特性程序冷凍中所用的滲透性冷凍保護劑主要為PROH、DMSO、甘油,由于它們的化學(xué)性質(zhì)不同,保護作用有所差異。Otoi等(1993)冷凍牛體外成熟卵母細胞的結(jié)果表明,從解凍后的形態(tài)正常率和受精率看,1.6mol/LPROH要優(yōu)于1.6mol/L甘油和1.6mol/LDMSO。Lim(1999)用1.0mol/LPROH、1.0mol/L甘油和1.0mol/LDMSO冷凍牛體外成熟卵母細胞的研究結(jié)果表明,解凍后的形態(tài)正常率、精子穿透率、卵裂率均是PROH和DMSO高于甘油,而8細胞率和桑椹胚率均是PROH高于DMSO和甘油。以上的研究結(jié)果表明,從冷凍牛體外成熟卵母細胞的效果來看,PROH優(yōu)于DMSO和甘油。本研究的結(jié)果表明,對于山羊GV期和IVM卵母細胞,解凍后的形態(tài)正常率均是PROH和DMSO優(yōu)于甘油;GV期卵母細胞的成熟率和IVM卵母細胞的受精率,均是PROH優(yōu)于DMSO和甘油,DMSO也優(yōu)于甘油。這與在牛上的研究結(jié)果類似。PROH之所以比DMSO和甘油具有較好的保護作用,是由其化學(xué)特性決定的。PROH毒性比DMSO小,而且滲透性極高,只需很短時間就能在凍結(jié)前進入細胞內(nèi);PROH的特性還有助于細胞質(zhì)在冷凍過程中變?yōu)闊o定型的狀態(tài),這種狀態(tài)在低溫下具有很大的穩(wěn)定性,這一特性可限制解凍時冰晶的形成。甘油廣泛用于牛胚胎的冷凍,因為它毒性低,然而,由于甘油膜滲透性低,誘導(dǎo)了對細胞質(zhì)的嚴(yán)重滲透性損傷。有報道認(rèn)為DMSO對骨架系統(tǒng)和糖酵解途徑有特殊的毒性。3.2不同培養(yǎng)階段卵母細胞的超微結(jié)構(gòu)和耐抗能力山羊卵母細胞發(fā)育階段對冷凍效果有重要影響,不論采用程序冷凍法,還是OPS玻璃化冷凍法,除形態(tài)正常率差異不顯著外,受精率、卵裂率均是IVM卵母細胞高于GV期和培養(yǎng)9h的,后兩者之間雖然差異不顯著,但培養(yǎng)9h略高于GV期的。這與Lim等(1992)在牛上的研究結(jié)果相類似。卵母細胞從GV期到MⅡ期的成熟過程中,要發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。在形態(tài)學(xué)方面,胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)在細胞器變化和紡錘體形成方面。已知冷凍過程會造成細胞器和細胞膜等膜性結(jié)構(gòu)的損傷。劉海軍等(2001)研究了OPS玻璃化冷凍對不同發(fā)育階段的山羊卵母細胞超微結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,從GV期→培養(yǎng)9h→IVM卵母細胞的冷凍損傷逐漸減小,主要表現(xiàn)在質(zhì)膜的損傷,以GV期卵最重,培養(yǎng)9h卵次之,IVM卵最輕;GV期卵未見微絨毛,線粒體有損傷,培養(yǎng)9h卵和IVM卵微絨毛保存較好,線粒體結(jié)構(gòu)完整。作者據(jù)此推論,從GV期到MⅡ期卵母細胞對冷凍的抵抗能力逐步提高,是一個漸進性的過程,隨著培養(yǎng)時間延長而增加。而本研究IVM卵母細胞冷凍以后的發(fā)育能力高于GV期和培養(yǎng)9h卵,表明IVM卵母細胞的抗凍性強。3.3冷卻iiim卵母細胞卵母細胞的程序冷凍方法是借鑒了胚胎冷凍的方法,主要采用慢速冷凍、快速解凍法,這種方法包括慢速或直接在約-7℃植冰,并保持幾分鐘,在以<1℃/min的速率降到約-30℃~-40℃投入液氮。卵母細胞必須經(jīng)歷低于10℃的一段時間。研究表明,牛卵母細胞對低溫非常敏感。Martino等(1996)報道,冷卻牛GV期卵母細胞至10℃,與對照組相比,卵裂率和囊胚率明顯下降,而冷卻至0℃的卵母細胞受到的影響更為嚴(yán)重。冷卻IVM卵母細胞的結(jié)果與冷卻GV期卵母細胞非常相似。牛卵母細胞對冷卻的極端敏感性,解釋了常規(guī)的慢速冷凍方法獲得很少的成功(囊胚率低于3%)。由于常規(guī)的慢速冷凍方法不能有效地克服牛卵母細胞的冷卻敏感性,研究者試圖尋找新的方法來克服這一問題。Vajta等(1998)研究了一種叫作OPS的新的玻璃化方法冷凍牛卵母細胞。OPS管直徑為普通細管的一半,包含有卵子的玻璃化溶液為1~2μl,冷凍時管端直接插入液氮,解凍時直接插入解凍液。經(jīng)OPS玻璃化冷凍的卵母細胞,其中一組的囊胚率達到25%,將囊胚移植給14個受體,生下了3個牛犢。據(jù)測定OPS管中液柱的平均冷卻速率,在-25℃~-175℃之間是22500℃/min,0℃~-195℃是16700℃/min,而普通細管則分別為2550℃/min和2438℃/min,OPS管的溫度變化速率比普通細管提高近10倍,冷卻速率的增加相應(yīng)地降低了冷卻損傷。在解凍過程中,OPS法的冷凍保護劑立即得到稀釋。卵母細胞在高濃度的保