DOJINDO操作闡明細(xì)胞活性檢測(cè)1.

在96

孔板中接種細(xì)胞懸液

(100ml/孔

)

。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)

(在37

℃，5%CO2的條件下

)。2.

向每孔加入10ml

的CCK-8溶液

(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響

O.D值的讀數(shù))

。3.

將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育

1-4小時(shí)。4.

用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5.

假如臨時(shí)不測(cè)定O.D值，打算后來(lái)測(cè)定的話，可以向每孔中加入

10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS

溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保留在室溫條件下。在

24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞增殖

-毒性檢測(cè)1.

在96

孔板中配制

100ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)

24小時(shí)

(

在37℃，

5%CO2的條件下

)。2.

向培養(yǎng)板加入10ml不一樣濃度的待測(cè)物質(zhì)。3.

將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段合適的時(shí)間

(例如:6,12,24

或48小時(shí)

)。4.

向每孔加入10mlCCK-8

溶液

(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響

O.D值的讀數(shù))

。5.

將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育

1-4小時(shí)。6.

用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。7.

假如臨時(shí)不測(cè)定O.D值，打算后來(lái)測(cè)定的話，可以向每孔中加入

10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS

溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保留在室溫條件下。在

24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：假如待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加

CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的狀況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸取即可。制作原則曲線1.

先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2.

按比例

(

例如：1/2比例

)

依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一種細(xì)胞濃度梯度，一般要做

3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。3.

接種后培養(yǎng)2-4

小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加

CCK-8試劑培養(yǎng)一定期間后測(cè)定

O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)

(X軸)

，O.D值為縱坐標(biāo)

(Y軸)

的原則曲線。根據(jù)此原則曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量

(使用此原則曲線的前提條件是試驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入

CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。DOJINDO檢測(cè)環(huán)節(jié)CCK-8檢測(cè)環(huán)節(jié)1.向各孔中加入100μl細(xì)胞懸液。a)2.在37℃下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)3.向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c)10μl。4.37℃下孵育。5.向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。6.37℃下孵育1-4小時(shí)。e)7.測(cè)定450nm處的OD值。a)使用合適的培養(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。b)提議使用CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。c)使用培養(yǎng)基或PBS來(lái)制備溶液。d)假如待測(cè)溶液有還原性，測(cè)定不含細(xì)胞，但具有CCK-8的待測(cè)溶液在450nm處的空白吸光度。假如該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8，假如吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100μl培養(yǎng)基和10μlCCK-8進(jìn)行檢測(cè)。e)白細(xì)胞也許需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。活力計(jì)算細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力問(wèn)答：1.一種孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞？當(dāng)使用原則96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的敏捷度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。假如要使用24孔板或6孔板試驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔對(duì)應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。2.能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，假如加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。3.能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。4.酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎？不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)導(dǎo)致影響。5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測(cè)之間與否有有關(guān)性？有。然而，請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測(cè)原理與胸苷檢測(cè)的不一樣，因此成果也許不一樣。6.CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測(cè)E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100μlE.coli培養(yǎng)液中加入10μlCCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。7.CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在0-5℃下可以保留至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保留1年。假如需要長(zhǎng)期保留，我們推薦-20℃的儲(chǔ)備條件。8.假如沒(méi)有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450nm到490nm之間的濾光片。9.怎樣減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來(lái)的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。10.CCK-8是什么顏色？應(yīng)當(dāng)是粉紅色。若顏色不一樣樣，有也許會(huì)影響測(cè)定。11.CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？不能。由于CCK8的重要成分是一種水溶性的四唑鹽(WST8)，并通過(guò)電子載體1MethoxyPMS將活細(xì)胞中的電子互換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。12.CCK8檢測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞與否有毒？CCK8溶液自身由于高濃度的1MethoxyPMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。不過(guò)，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒(méi)有毒性的，由于被稀釋了10倍。因此，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，如過(guò)夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一種細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè)，如結(jié)晶紫檢測(cè)，中性紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不一樣，因此在需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測(cè)一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。13.在做加藥試驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測(cè)定與否有影響？怎樣處理？有時(shí)會(huì)有影響。假如藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增長(zhǎng)吸光度。處理措施：首先要確認(rèn)藥物與否有吸取，在具有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測(cè)定450nm的吸光度，假如它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14.每次測(cè)定的數(shù)值不一樣樣，是什么原因？怎樣處理？也許會(huì)有如下幾種原因：1.當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最輕易干燥揮發(fā)，由于體積不精確而增長(zhǎng)誤差。一般狀況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。2.有也許會(huì)由于CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，提議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以協(xié)助混勻。3.每孔的細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少。請(qǐng)預(yù)先在1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)探索條件。15.怎樣設(shè)定空白對(duì)照？在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥試驗(yàn)(細(xì)胞毒性試驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸取，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450nm的吸光度作為空白對(duì)照。16.哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定？當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定，例如具有維生素C的Glucose等(一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測(cè)定)。在有酚紅存在的狀況下，會(huì)增長(zhǎng)空白吸取，但不影響測(cè)定，扣除空白吸取即可。17.在試驗(yàn)中吸光度值太高，假如不能減少細(xì)胞數(shù)量，怎樣處理？可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。18.設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長(zhǎng)沒(méi)有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來(lái)的吸取。19.闡明書(shū)上僅寫(xiě)了96孔板的測(cè)定措施，假如使用24孔板貨12孔板，應(yīng)當(dāng)加多少許CCK-8試劑？…一般狀況下提議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。20.在CCK-8顯色過(guò)程中，怎樣終止反應(yīng)？有一下幾種措施（96孔板）：1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。2、每孔加10μl0.1MHCL溶液。3、每孔加10μl1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。21.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？不一定。假如要向保持細(xì)胞的最佳狀態(tài)，提議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。假如不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶也許會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做原則曲線和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。22.假如加入的藥物中具有金屬，與否會(huì)有影響？金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)克制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使敏捷度降級(jí)。假如終濃度是10Mm的話，將會(huì)100%克制。23.CCK-8試劑的保留條件？在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保留一年。假如需要保留較長(zhǎng)時(shí)間的話，推薦在-20℃下保留。不過(guò)CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增長(zhǎng)空白吸取，從而影響檢測(cè)成果，若常常使用可將試劑寄存在4℃冰箱內(nèi)保留。24.預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？一般狀況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。假如想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。25.CCK-8對(duì)于不一樣的細(xì)胞，敏捷度與否同樣？不一樣樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則也許吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量來(lái)處理。26.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較輕易，若細(xì)胞數(shù)量過(guò)大，有時(shí)吸光度會(huì)超過(guò)酶標(biāo)儀的讀數(shù)。27.應(yīng)當(dāng)每次做原則曲線嗎？提議每次做。雖然細(xì)胞是同樣的，不過(guò)細(xì)胞的狀態(tài)不一定同樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣樣的細(xì)胞，提議每次做原則曲線。假如試劑的批號(hào)不一樣樣，敏捷度也許會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不一樣的批號(hào)提議分別做原則曲線。28.有時(shí)在藥物作用狀況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，不過(guò)