國家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書撰寫指導(dǎo)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院韓蘇夏國家自然科學(xué)基金的重要性醫(yī)院需要科室需要團(tuán)隊(duì)需要個(gè)人需要學(xué)科標(biāo)志爭論力氣團(tuán)隊(duì)建設(shè)人才培育申請(qǐng)書撰寫前的預(yù)備認(rèn)真閱讀《國家自然科學(xué)基金條例》等相關(guān)文件理思路----擅長覺察臨床中存在的問題，明確自己思路找問題----通過臨床問題凝練出學(xué)科爭論的科學(xué)問題、假說、假設(shè)申請(qǐng)書撰寫前的預(yù)備看文獻(xiàn)尋方向------1年、3年、5年內(nèi)大雜志、大綜述，通過文獻(xiàn)查找科學(xué)問題、假說、假設(shè)是否成立的依據(jù)選課題--------選題最好以問題為導(dǎo)向，不要以技術(shù)為導(dǎo)向，需要留意方向性，創(chuàng)新性，有用性和可行性前期鋪墊-----預(yù)試驗(yàn)結(jié)果2023/10/315標(biāo)題標(biāo)題是申請(qǐng)書的靈魂、精華和核心，是摘要的高度概括。標(biāo)題是你對(duì)評(píng)審專家說的第一句話,應(yīng)表達(dá)創(chuàng)新點(diǎn)，新穎，吸引眼球！簡潔明確，具體清晰！有新意的關(guān)鍵詞可以刻意凸現(xiàn)!撰寫模式一般承受“爭論方法〔手段〕+爭論對(duì)象+爭論目標(biāo)”的模式〔需要依次表達(dá)清晰〕，不宜過長，字?jǐn)?shù)≤30留意事項(xiàng)創(chuàng)新、創(chuàng)新、再創(chuàng)新簡潔明確、修辭正確、有感召力和可信度檢索類似標(biāo)題，避開撞車盡量不要簡寫2023/10/316HCV感染及其所致肝癌經(jīng)基因組免疫途徑防治的試驗(yàn)爭論宮頸癌診斷新策略：通過FRET設(shè)計(jì)的TAT－波長轉(zhuǎn)換雙分子信標(biāo)應(yīng)用的根底爭論重組慢病毒介導(dǎo)TAT-apoptin融蛋白治療肝癌的試驗(yàn)爭論Apoptin特異性誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制：MAP4K4及其下游分子扮演角色？DDRsignaling誘導(dǎo)Apoptin促腫瘤放射增敏治療的爭論

標(biāo)題2023/10/317基本信息申報(bào)日期準(zhǔn)確、恰當(dāng)〔可向科研治理人員詢問〕申請(qǐng)人信息準(zhǔn)確，工作時(shí)間每年不少于六個(gè)月資助類別、爭論期限和申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)要恰當(dāng)中英文關(guān)鍵詞正確、標(biāo)準(zhǔn)2023/10/318投送學(xué)科認(rèn)真分析當(dāng)年的招標(biāo)指南。分析自己申報(bào)課題的領(lǐng)域和爭論范圍。對(duì)于正在進(jìn)展的爭論，留意覺察有根底性工作與招標(biāo)指南是可以靠得上的？即便是靠不上，也要留意聯(lián)系和搭車。對(duì)于擬開展的爭論，要留意整合各類資源〔尋常的信息積存〕。分析各個(gè)學(xué)科口的指南，查找最恰當(dāng)?shù)膶W(xué)科投送?！u(píng)審人〔專家心態(tài)：只有很少的份額呀10～15%，究竟給誰呢？〕2023/10/319摘要是敲門磚摘要是整個(gè)申請(qǐng)書的提綱，是申請(qǐng)人最終寫的，卻是評(píng)審專家最先看的內(nèi)容，因此是申請(qǐng)書的重中之重，確定要反復(fù)修改，精益求精！要求：在短短的幾百字內(nèi)要使外行和內(nèi)行評(píng)審人，感覺到摘要內(nèi)容布滿著新意、撰寫和闡述的條理性特殊清晰。能夠引起進(jìn)一步閱讀的興趣。到達(dá)的目標(biāo)：通過批閱摘要，了解到你所申請(qǐng)工程目前爭論存在的科學(xué)問題、現(xiàn)狀，想要做什么、怎么做、爭論的目的和重要意義。2023/10/3110摘要一般撰寫格式應(yīng)用根底爭論目前應(yīng)用存在問題是…爭論目的…選用…材料，使用…技術(shù)，承受…方法，實(shí)現(xiàn)…目標(biāo)為……奠定根底／供給……思路2023/10/3111既往使用表達(dá)自殺基因的復(fù)制缺欠病毒治療惡性腫瘤的爭論中，覺察復(fù)制缺欠病毒不能將治療基因全部轉(zhuǎn)導(dǎo)至體內(nèi)全部的腫瘤細(xì)胞，而啟動(dòng)自殺基因只能殺死導(dǎo)入治療基因的腫瘤，殘存瘤細(xì)胞會(huì)快速的增殖，導(dǎo)致治療的失敗。本課題目的是探尋更有效、安全和特異治療惡性腫瘤的生物學(xué)方法。我們選用雞貧血病毒特異誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(不損害正常細(xì)胞)的VP3(apoptin)為目的基因，使用重組慢病毒技術(shù)來增加目的基因在肝癌內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)力氣；使用信號(hào)肽和引導(dǎo)肽序列來實(shí)現(xiàn)非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后的長期持續(xù)分泌表達(dá)；承受Ant-apoptin和TAT-apoptin融合表達(dá)方式保證治療分子可以進(jìn)入未轉(zhuǎn)導(dǎo)重組病毒的剩余瘤細(xì)胞和已經(jīng)轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞,并確保治療分子導(dǎo)入瘤細(xì)胞核內(nèi)的靶部位。這樣，在確保安全性的同時(shí)也增加其治療作用，為肝癌的基因治療創(chuàng)立新方法和更有效的手段，使腫瘤的基因治療有新突破。2023/10/3112根底爭論用……方法〔手段〕進(jìn)展……爭論，探究/證明……問題，對(duì)說明……機(jī)制／提示……規(guī)律有重要意義，為……奠定根底／供給……思路如是連續(xù)工程，請(qǐng)簡述前期結(jié)果，提出新問題摘要一般撰寫格式2023/10/3113本課題組前期爭論結(jié)果證明：Apoptin——這一來源于雞貧血病毒的小蛋白，能夠特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無凋亡誘導(dǎo)作用。MAP4K4是一種絲蘇氨酸蛋白激酶，與Apoptin存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。我們前期試驗(yàn)覺察MAP4K4在肝臟腫瘤中的表達(dá)高于肝正常組織，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)作出大膽推想：MAP4K4使Apoptin磷酸化，磷酸化后的Apoptin發(fā)生多聚化并與某些蛋白質(zhì)結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合體移位至細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核的復(fù)合體與核內(nèi)的DNA結(jié)合影響DNA的有效轉(zhuǎn)錄合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本課題擬通過調(diào)整MAP4K4表達(dá)水平，觀看其對(duì)Apoptin特異性誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)變，爭論MAP4K4及其下游分子在Apoptin特異性誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。通過以上爭論說明Apoptin誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為探尋新的腫瘤標(biāo)志物，且開展以此為靶標(biāo)的腫瘤診療奠定理論根底。2023/10/3114立項(xiàng)依據(jù)〔字?jǐn)?shù)把握在2500字以內(nèi)〕爭論意義撰寫模式爭論領(lǐng)域→主要問題→熱點(diǎn)爭論方向熱點(diǎn)爭論方向→尚未解決的具體科學(xué)問題→提出假設(shè)→闡述解決該問題〔爭論目標(biāo)〕的科學(xué)奉獻(xiàn)〔理論意義或應(yīng)用前景〕留意事項(xiàng)規(guī)律性強(qiáng)，條理清晰；提出的問題準(zhǔn)確，設(shè)想在理論上可行寫成國內(nèi)外爭論現(xiàn)狀，沒有提煉出爭論的意義完全沒有闡述課題的根本爭論內(nèi)容闡述爭論的必要性、意義和價(jià)值對(duì)科學(xué)意義的闡述缺乏或夸大2023/10/3115原發(fā)性肝癌(primaryhepatocelluarcarcinoma)是一種常見的惡性腫瘤,適于手術(shù)切除的病例很少，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)60-80%，而放療和化療的緩解率又很低。我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年約有10萬人死于肝癌，占我國惡性腫瘤死亡的其次位[1]。因此肝癌的治療爭論是急需解決的重要課題，新的治療藥物爭論迫在眉睫,而基于腫瘤起源、進(jìn)展的簡潔性，探尋一種有效的、安全的、特異的、提高緩解率的治療藥物更是當(dāng)務(wù)之急。十年前已經(jīng)開頭爭論使用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)殺傷基因來治療肝癌,此技術(shù)對(duì)體外培育的腫瘤細(xì)胞顯示了抱負(fù)的殺傷作用,人們對(duì)此寄以很高的期望，但使用于臨床病人和在體的肝癌動(dòng)物時(shí),其療效是不令人滿足的，緣由是其基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá)水平偏低。因此，雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒等各種病毒載體相繼被爭論者使用,但距期望的效果甚遠(yuǎn)。究其緣由,認(rèn)為與重組病毒的非復(fù)制性有關(guān)。由于任何一種非復(fù)制性重組病毒,無論通過哪種使用方法，均不行能感染實(shí)體瘤組織內(nèi)或已經(jīng)轉(zhuǎn)移的全部腫瘤細(xì)胞，自殺基因只能使轉(zhuǎn)導(dǎo)了病毒的腫瘤細(xì)胞死亡，隨著已轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的腫瘤細(xì)胞死亡,治療基因的表達(dá)也就趨于終止，未轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的腫瘤細(xì)胞會(huì)快速生長使腫瘤復(fù)發(fā)。病毒的非復(fù)制性是確保其安全性的保證,雖然近來也有爭論者使用條件性復(fù)制病毒和對(duì)人類少有致病性的復(fù)制性微小病毒治療實(shí)體瘤的爭論報(bào)告,但其安全性仍不能確保，人類將面臨試驗(yàn)室產(chǎn)生的、能消滅人類的新病毒。因此，在確保安全性的條件下,需探尋一種使用非復(fù)制重組病毒有效殺傷實(shí)體瘤的新理論和新方法。立項(xiàng)依據(jù)國內(nèi)外爭論現(xiàn)狀及進(jìn)展動(dòng)態(tài)分析包括爭論現(xiàn)狀，存在問題，解決思路！撰寫要點(diǎn)從爭論領(lǐng)域切入，引出當(dāng)前的熱點(diǎn)爭論方向從爭論方向開放，說明在該方向上存在的問題圍繞存在的問題，提出該方面的空白點(diǎn)、未知數(shù)和難點(diǎn)呈現(xiàn)我們解決問題的理論依據(jù)或試驗(yàn)依據(jù)適時(shí)適量地提示我們的前期工作必要時(shí)對(duì)擬承受的技術(shù)方法進(jìn)展介紹和分析準(zhǔn)確提煉出本工程的爭論設(shè)想近年來，體外增殖雞貧血病毒(chickenanemiavirus,CAV)的爭論結(jié)果說明：CAV僅在轉(zhuǎn)化的雞細(xì)胞系復(fù)制，而且依靠轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特定細(xì)胞組分來完成自己的復(fù)制，這一生物學(xué)特征也在人源細(xì)胞系的試驗(yàn)中得到證明。分子病毒學(xué)爭論說明：CAV的VP3蛋白〔又稱Apoptin〕和VP2蛋白協(xié)同作用,轉(zhuǎn)變細(xì)胞線粒體的膜電位使線粒體釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的快速凋亡[2,3]。體外合成或基因工程表達(dá)的CAVApoptin特異的引起多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡[3,4],但對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無作用[5,6]。這種對(duì)細(xì)胞的選擇性凋亡方式，說明Apoptin在將來腫瘤治療中具有迷人的巨大應(yīng)用前景[7],這種特異性殺傷腫瘤細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞,不損害正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)和相關(guān)肽的覺察為使用重組病毒治療腫瘤帶來了轉(zhuǎn)機(jī)。進(jìn)一步的爭論說明，Apoptin的腫瘤細(xì)胞特異性與其在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位有關(guān)，在轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞中，Apoptin定位于細(xì)胞核，而在正常細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)。Apoptin的磷酸化準(zhǔn)備其核定位，在腫瘤細(xì)胞中，Apoptin被磷酸化，磷酸化的Apoptin進(jìn)入細(xì)胞核，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且Apoptin的表達(dá)水平是誘導(dǎo)凋亡有效性的重要取決條件[8]。因此，我們使用重組慢病毒技術(shù)來表達(dá)這類蛋白質(zhì)和肽物質(zhì),以提高Apoptin的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并使其能夠持續(xù)高表達(dá)。當(dāng)重組病毒注射到實(shí)體瘤之后,它既能感染腫瘤細(xì)胞又能感染實(shí)體瘤中的非腫瘤細(xì)胞,在感染了重組病毒的腫瘤細(xì)胞死亡之后,非腫瘤細(xì)胞不會(huì)由于表達(dá)這些蛋白消逝任何損害,它在一個(gè)較長的時(shí)間內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)殺傷腫瘤細(xì)胞的分子。同時(shí)一些爭論提示，有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡既需要Apopotin的高表達(dá)也需要其核定位[9,10]。雖然在Apoptin的分子構(gòu)造中存在核定位信號(hào)[11,12,13],但在人和動(dòng)物的實(shí)體瘤內(nèi),如肝癌,實(shí)現(xiàn)以上條件還有很大技術(shù)困難[14,15]。假設(shè)我們能通過分泌表達(dá)原理,在表達(dá)分子的氨基或氨基端融合一種具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)造域(PTD)的肽,非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分子就會(huì)自由進(jìn)入殘存的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞起到持續(xù)性追殺腫瘤的目的，這樣蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)造域(PTD)就增加了Ant-Apoptin或TAT-Apoptin向細(xì)胞和細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述思想在確保重組病毒安全性的條件下,提高并持續(xù)性增加了殺傷腫瘤的蛋白質(zhì)和肽的表達(dá)，在理論上具有迷人的前景，為治療實(shí)體瘤找到了安全,特異和有效的生物治療方法。重組慢病毒載體是近年來使用的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的病毒載體,在改造HIV的病毒的復(fù)制元件并提高了安全性后,使用泡沫口炎病毒衣殼蛋白作為重組病毒的衣殼,大大提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,同時(shí)感染分裂和非分裂細(xì)胞。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)造域(PTD)是近年來覺察的一種非受體依靠和非能量依靠的新轉(zhuǎn)導(dǎo)理論和方法[16,17]。爭論最多的是果蠅Antennapediahomeodomainprotein(Ant)和HIV的TAT,它們能夠攜帶核酸,蛋白和肽自由的通過細(xì)胞膜和核膜[18,19]。依據(jù)這個(gè)理論，我們已經(jīng)成功的表達(dá)了P53的羧基肽-Ant融合肽，其誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡。本課題設(shè)計(jì)使用改造病毒載體的目的不但是為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,而且在表達(dá)盒中設(shè)計(jì)了可分泌表達(dá)的信號(hào)肽-引導(dǎo)肽元件。承受Ant和TAT-Apoptin融合表達(dá)技術(shù)[20,21,22],目的是促進(jìn)Apoptin進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核并促使已表達(dá)的Apoptin無阻礙的進(jìn)入毗鄰的甚至已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞[23,24]。當(dāng)重組病毒感染腫瘤細(xì)胞后除了能殺死該細(xì)胞之外,它分泌的目的蛋白可以殺死毗鄰的腫瘤細(xì)胞;更重要的是當(dāng)腫瘤內(nèi)的非腫瘤細(xì)胞,如間質(zhì)細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了重組病毒后，表達(dá)的Ant-Apoptin和TAT-Apoptin不損害這些非腫瘤細(xì)胞,它們可以長期存活并長期表達(dá)可分泌的目的蛋白,對(duì)實(shí)體瘤內(nèi)的殘存腫瘤細(xì)胞和已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞,起到長期持續(xù)的殺傷作用。這在以前的腫瘤基因治療爭論中是無法完成的。我們期望該課題的爭論能夠?yàn)槟[瘤的基因治療進(jìn)入臨床開拓新道路。本課題的爭論是探尋有效的、安全的和特異的治療惡性腫瘤的生物學(xué)方法。我們選用了雞貧血病毒的VP3,Apoptin蛋白作為治療腫瘤的特異分子,使用重組慢病毒技術(shù)來增加目的基因在實(shí)體瘤內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)力氣,使用信號(hào)肽和引導(dǎo)肽序列來實(shí)現(xiàn)非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后的長期持續(xù)分泌表達(dá).承受Ant-Apoptin和TAT-Apoptin融合表達(dá)方式,保證治療分子可以進(jìn)入未轉(zhuǎn)導(dǎo)重組病毒的剩余腫瘤細(xì)胞和已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞,并確保治療分子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的靶部位。通過以上設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌等實(shí)體瘤安全有效的特異性治療。立項(xiàng)依據(jù)國內(nèi)外爭論現(xiàn)狀及進(jìn)展動(dòng)態(tài)分析留意事項(xiàng)層層開放、強(qiáng)調(diào)分析綜合；著重找出別人爭論的缺乏或缺陷綜述不全面，無視了重要進(jìn)展，提出的問題別人已解決圍繞課題的思路進(jìn)展綜述，層次清晰，觀點(diǎn)鮮亮規(guī)律思路不清晰，沒有圍繞一個(gè)中心問題進(jìn)展綜述爭論現(xiàn)狀和分析準(zhǔn)確客觀論述既要充分又要簡練簡潔移植或夸大，可行性差文獻(xiàn)類別要全：以國外文獻(xiàn)為主，也要引用國內(nèi)同行知名專家的文獻(xiàn)；引文信息要全；文獻(xiàn)年月要新：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有申報(bào)當(dāng)年的最新文獻(xiàn)。撰寫模式作者姓名、題目、具體出處(包括期刊名、年份、卷期、頁碼等)，20～30條；新，精，準(zhǔn)！留意事項(xiàng)正文中重要的論點(diǎn)均要有文獻(xiàn)標(biāo)注引文信息，格式標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，與正文相對(duì)應(yīng)盡可能引用最新的英文文獻(xiàn)〔近三年占到2/3左右〕和頂級(jí)期刊文獻(xiàn)常見問題：過于陳舊；參考文獻(xiàn)不夠全面；格式不統(tǒng)一立項(xiàng)依據(jù)研究目標(biāo)爭論目標(biāo)撰寫要點(diǎn)指爭論要到達(dá)的目的〔最終結(jié)果〕，是對(duì)標(biāo)題進(jìn)一步的具體化，是爭論對(duì)象、爭論方法、成果和應(yīng)用的高度概括。不能夠轉(zhuǎn)寫成為爭論內(nèi)容中階段性成果的排列。通常使用一、兩句話表達(dá)清晰。一般撰寫格式明確……關(guān)系，提示……規(guī)律，說明……原理〔機(jī)制〕，建立……方法等。探尋一種治療肝癌等實(shí)體瘤安全的、有效的、特異的生物學(xué)方法,為實(shí)體瘤的基因治療帶來新突破研究目標(biāo)研究內(nèi)容爭論內(nèi)容是指圍繞爭論目標(biāo)擬開展的試驗(yàn)爭論。內(nèi)容要適當(dāng)：確保爭論周期內(nèi)完成；為目標(biāo)效勞：與爭論目標(biāo)相輔相成；要重點(diǎn)闡述：留意與技術(shù)路線區(qū)分。撰寫要求圍繞爭論目標(biāo)逐次開放爭論內(nèi)容層次清晰爭論方法恰當(dāng)，可操作性強(qiáng)，具有可行性留意事項(xiàng)內(nèi)容要適當(dāng)，確保爭論周期內(nèi)完成內(nèi)容要適當(dāng)，確保爭論周期內(nèi)完成內(nèi)容過多，爭論周期難以完成為目標(biāo)效勞，闡述重點(diǎn)內(nèi)容分散，不能集中說明爭論目標(biāo)；與爭論方案混淆，排列試驗(yàn)步驟問題準(zhǔn)確，方法科學(xué)、先進(jìn)克隆CAVVP3的基因克?。簭幕疾‰u的外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)分別DNA,使用PCR方法建立CAVVP3/apoptin克隆,測(cè)序證明(已完成)。構(gòu)建具有信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-TAT(Ant)-apoptin表達(dá)盒：在已經(jīng)構(gòu)建的NT4信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-ADNF重組載體中使用酶切獵取NT4信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-cDNA片段,合成TAT(Ant)滲透肽cDNA片段,通過HindIII同apoptin基因連接構(gòu)建TAT(Ant)-appotin融合基因片段,通過常規(guī)分子生物方法構(gòu)建NT4信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-TAT(Ant)-apoptin表達(dá)盒。構(gòu)建表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒：使用常規(guī)分子生物學(xué)方法將NT4信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-TAT(Ant)-apoptin表達(dá)盒插入到慢病毒重組載體pLenti6/V5-D-TOPO載體中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,Blasticidin篩查陽性轉(zhuǎn)化克隆,增殖后收獲表達(dá)目的基因的重組病毒。構(gòu)建表達(dá)TAT(Ant)-EGFP報(bào)告基因的重組慢病毒：使用常規(guī)分子生物學(xué)方法將NT4信號(hào)肽-引導(dǎo)肽-TAT(Ant)-EGFP表達(dá)盒插入到慢病毒重組載體pLenti6/V5-D-TOPO載體中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,Blasticidin篩查陽性轉(zhuǎn)化克隆,增殖后收獲表達(dá)報(bào)告基因的重組病毒。表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的體外治療作用：培育P53缺失,P53變異和具有野生性P53的肝癌細(xì)胞,感染表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒和表達(dá)TAT(Ant)-EGFP報(bào)告基因的重組慢病毒,觀看轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和使腫瘤凋亡力氣。表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒對(duì)裸鼠移植瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的治療作用：接種肝癌細(xì)胞到裸鼠皮下,制備移植瘤和移植后轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型,腫瘤注射表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒,通過病理學(xué)檢測(cè)觀看對(duì)腫瘤治療作用和對(duì)轉(zhuǎn)移病灶的治療作用。表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒誘導(dǎo)腫瘤凋亡的特異性和安全性：分別人成纖維細(xì)胞和臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,體外培育和轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒,觀看目的基因的表達(dá)和對(duì)非腫瘤細(xì)胞的影響.將表達(dá)TAT(Ant)-apoptin的重組慢病毒和表達(dá)TAT(Ant)-EGFP報(bào)告基因的重組慢病毒注射到小鼠肝臟,病理學(xué)檢查目的基因的表達(dá)和對(duì)正常肝細(xì)胞的影響。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題什么是關(guān)鍵科學(xué)問題？關(guān)鍵科學(xué)問題--是指爭論過程中對(duì)到達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些爭論內(nèi)容或因素，以及為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必需把握的關(guān)鍵技術(shù)或爭論手段，包括課題設(shè)計(jì)中具體的關(guān)鍵科學(xué)問題和技術(shù)問題。提煉１－２個(gè)，為什么？意義何在？撰寫模式自己爭論的領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問題→本爭論規(guī)律思路→意義→已具備的科學(xué)覺察、硬件和軟件條件→最關(guān)鍵問題的解決方案留意事項(xiàng)：找準(zhǔn)關(guān)鍵問題，并提出解決方法；特殊留意必要時(shí)供給試驗(yàn)失敗候選方案不會(huì)總結(jié)，未能抓住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)；過于簡潔；和其他局部重復(fù)研究方案爭論方案是指課題實(shí)施中具體的、可執(zhí)行的工作方案和流程，應(yīng)對(duì)該局部予以強(qiáng)有力的支持和說明，使評(píng)審專家感到試驗(yàn)設(shè)計(jì)得合理、可行，能夠獲得良好試驗(yàn)結(jié)果。撰寫要求：以爭論工程的需求為前提，盡量承受最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)表達(dá)在技術(shù)路線當(dāng)中。常見問題過于簡潔：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。過于繁雜：大量排列一些常規(guī)的試驗(yàn)方法。研究方法爭論方法撰寫要點(diǎn)爭論方法〔擬實(shí)行的爭論方案及可行性分析〕。主要指在爭論的過程中，所應(yīng)用到〔承受〕的方法學(xué)問題包括：有關(guān)試驗(yàn)方法、手段、技術(shù)路線和方案、關(guān)鍵技術(shù)等，均應(yīng)賜予強(qiáng)有力的支持和說明，使評(píng)審人感到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理、可行、能夠獲得良好的試驗(yàn)結(jié)果。此段描述不好的缺陷是讓人感覺到試驗(yàn)不行行或者根本完不成課題的試驗(yàn)。同時(shí)留意試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍，太大使人感到不易完成，太小使人感到份量不夠。技術(shù)路線技術(shù)路線撰寫要點(diǎn)實(shí)際上是完成課題的試驗(yàn)流程圖。針對(duì)爭論目標(biāo)、爭論內(nèi)容、爭論方法等所制定的合理、可行的路徑，這個(gè)路徑使評(píng)閱人能夠清晰的看明白。描述時(shí)確定要與前面的爭論目的、爭論內(nèi)容、爭論目標(biāo)等內(nèi)容有親切的關(guān)聯(lián)，這幾個(gè)環(huán)節(jié)親切相關(guān)相互連接。到達(dá)爭論目標(biāo)明確、爭論內(nèi)容充實(shí)、爭論范圍合理、試驗(yàn)設(shè)計(jì)較為完善、技術(shù)路線可行?？尚行苑治隹尚行苑治?-考察課題組是否有力氣和條件完成所申請(qǐng)的課題。從思路、技術(shù)、條件和人員角度，使用中性詞，給出具體理由,能夠說服評(píng)審專家！撰寫模式對(duì)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的理論分析爭論手段方法分析預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分析對(duì)相關(guān)條件的分析留意事項(xiàng)理論可行性、條件可行性、爭論根底可行性不知道從何處開頭分析；不知道哪些問題可以表達(dá)課題設(shè)計(jì)的可行性簡潔讓人疑心的爭論內(nèi)容和方案需要特殊說明舉例：理論上具有可行性：……有前期試驗(yàn)結(jié)果支持：……良好的爭論工作根底：……專業(yè)互補(bǔ)的課題組成員：……技術(shù)成熟：……試驗(yàn)設(shè)備有保障：……可行性分析特色與創(chuàng)新特色與創(chuàng)新即在本工程爭論領(lǐng)域中申請(qǐng)者與國內(nèi)外同行所不同。應(yīng)從對(duì)包括工程的立論依據(jù)、爭論內(nèi)容、爭論方法與手段、技術(shù)路線及其試驗(yàn)方案上的爭論與創(chuàng)新點(diǎn)進(jìn)展概括、提煉并集中反映出來。學(xué)術(shù)思想〔理論〕的創(chuàng)新資源創(chuàng)新技術(shù)或者方法學(xué)的創(chuàng)新創(chuàng)新點(diǎn)可以表達(dá)近期的爭論成果，更要突出深入和連續(xù)爭論的必要性。本工程的特色與創(chuàng)新之處的撰寫要點(diǎn)假設(shè)創(chuàng)新——通過試驗(yàn)、臨床過程，提出……爭論的假設(shè)，期望通過……手段和方法證明……假設(shè)？思路創(chuàng)新——與既往爭論不同的設(shè)計(jì)思路，期望通過……方法和手段證明……是思路創(chuàng)新？技術(shù)或者方法創(chuàng)新——承受何種試驗(yàn)方法，試驗(yàn)技術(shù)解決工程中……關(guān)鍵問題。資源創(chuàng)新——疾病家系、血清庫、標(biāo)本庫、數(shù)據(jù)庫等。特色與創(chuàng)新一般寫作格式本爭論的特色是從……方面入手，對(duì)………的問題進(jìn)展?fàn)幷?，期望說明……，提示……機(jī)制。這些爭論在國內(nèi)外鮮有報(bào)告。此外，通過……的爭論，為臨床的應(yīng)用供給……試驗(yàn)根底。特色與創(chuàng)新年度計(jì)劃年度爭論準(zhǔn)備撰寫要點(diǎn)留意要客觀、合理的劃分年度準(zhǔn)備進(jìn)展，以表達(dá)所制定的目標(biāo)能夠完成。留意論文撰寫篇數(shù)和質(zhì)量，包括：SCI、MI、EI、國內(nèi)統(tǒng)計(jì)源或者核心期刊、國內(nèi)外學(xué)術(shù)會(huì)議等。年度爭論準(zhǔn)備撰寫要點(diǎn)人才培育〔爭論團(tuán)隊(duì)、博士、碩士爭論生培育〕，一般面上工程，培育1～2名博士或者2～3名碩士，不要太多。一般預(yù)留出6個(gè)月的時(shí)間進(jìn)展總結(jié)。此段撰寫的目標(biāo)根本上是依據(jù)課題的爭論內(nèi)容、爭論方法和技術(shù)路線所制定的方案進(jìn)展。切記爭論內(nèi)容、范圍、工作量的把握，撰寫的太大、太多不易完成。年度計(jì)劃預(yù)期研究成果預(yù)期爭論成果撰寫要點(diǎn)理論成果——在某一理論方面有所建樹、創(chuàng)新。應(yīng)用成果——在某項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)、方法學(xué)上獲得創(chuàng)新。預(yù)期爭論成果與“爭論特色和創(chuàng)新”根本上應(yīng)當(dāng)全都。預(yù)期爭論結(jié)果也還包括：擬組織的國內(nèi)、外重要學(xué)術(shù)溝通活動(dòng)、國際合作工程、溝通準(zhǔn)備、發(fā)表學(xué)術(shù)論文等。預(yù)期結(jié)果要考慮對(duì)根底和有用雙重的價(jià)值，假設(shè)能夠建立一套實(shí)物體系是最正確的結(jié)果。一般發(fā)表論文和申請(qǐng)專利結(jié)題比較簡潔。好標(biāo)志是SCI收錄的雜志。最終結(jié)題狀況是基金委專家們最關(guān)心的事情。預(yù)期研究成果舉例：理論成果：建立/豐富/補(bǔ)充/填補(bǔ)……技術(shù)方法：建立/完善……專利成果：可望獲得……論文專著：SCI論文〔具體數(shù)〕、學(xué)術(shù)著作〔具體數(shù)〕人才培育：青年科技骨干、博碩爭論生預(yù)期研究成果研究基礎(chǔ)工作根底包括申報(bào)者個(gè)人、團(tuán)隊(duì)或?qū)W校相關(guān)工作根底、人員和設(shè)備資源。學(xué)術(shù)積存，方法和技術(shù)建立(特殊是關(guān)鍵技術(shù)),預(yù)試驗(yàn)結(jié)果！撰寫模式工程的理論根底、前期工作覺察的問題、預(yù)試驗(yàn)爭論結(jié)果所在單位的爭論工作的積存；技術(shù)平臺(tái)的建立和必備設(shè)備的來源有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)受；爭論人員梯