免疫組化的原理及流程介紹主要內(nèi)容免疫組化原理及流程介紹一.免疫組化的開展簡(jiǎn)史二.免疫組化的原理三.免疫組化的根本流程四.免疫組化的結(jié)果分析免疫組化原理及流程介紹一.開展簡(jiǎn)史1941年Coons首先用熒光素標(biāo)記抗體—檢測(cè)肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。60年代Akanke建立酶標(biāo)抗體技術(shù)——鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù)。70年代Stemberger改進(jìn)上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶——抗體過氧化物酶〔PAP〕技術(shù)，使免疫細(xì)胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用。80年代Hsu等建立了抗生物素—生素〔ABC〕法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。90年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)分類方法迅速開展。2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的根本技術(shù)之一。免疫組化原理及流程介紹二免疫組化的原理免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反響和組織化學(xué)的呈色反響，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。免疫組化原理及流程介紹它把免疫反響的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。三免疫組化的根本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶3.抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇4.封閉非特異性蛋白5.一抗孵育

6.二抗孵育

7.SP反響8.顯色9.復(fù)染、脫水、透明、封片

2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化脫蠟與水化的目的是確?？贵w等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反響。假設(shè)脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反響和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

60℃×20min→Xylene：2×10minutes；100%absoluteethanol：2×5minutes；95%ethanol2minutes；80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；PBS洗3×3min。具體操作免疫組化原理及流程介紹2.細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反響。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。(1)細(xì)胞通透免疫組化原理及流程介紹(2)封閉內(nèi)源性過氧化酶其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反響結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進(jìn)行滅活。1)用封閉通透液浸潤(rùn)切片30min〔RT避光〕。其配法是用預(yù)熱40mlPBS加120ulTritonX-100加熱幾分鐘，在臨用前加400ul的30％H2O2。2)PBS溶液洗3次×3min。免疫組化原理及流程介紹具體操作:免疫組化原理及流程介紹3.抗原修復(fù)暴露抗原決定簇

由于組織中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。免疫組化原理及流程介紹常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。

抗原修復(fù)的主要方法:酶消化方法一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原應(yīng)用高頻電磁波翻開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵免疫組化原理及流程介紹將切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液〔pH6.0〕后，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約4次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片。2)PBS溶液洗3次×3min。具體操作〔微波修復(fù)〕：1)免疫組化原理及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織切片上有些剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反響的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合。免疫組化原理及流程介紹將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清〔與二抗來源一致〕后放入濕盒中,室溫(約30℃)下10～30min。具體操作：大一點(diǎn)免疫組化原理及流程介紹5.一抗孵育一抗:可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。一抗孵育條件在免疫組化反響中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最正確；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，然后4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接參加已稀釋的一抗〔1：250、500、1000〕后，放入濕盒中室溫1小時(shí)，然后4度過夜，冰箱中取出后需37℃復(fù)溫45min。免疫組化原理及流程介紹具體做法：免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)〕，作用是檢測(cè)一抗。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。免疫組化原理及流程介紹1)將一抗倒掉并用PBS洗5min×5次；2)用濾紙將圓圈周圍的水吸去，參加已稀釋的二抗后放入37℃恒溫烤箱中30min。3)用PBS洗5次×5min免疫組化原理及流程介紹具體操作：7.SP反響SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白生物素過氧化酶連接法。該法是ABC法根底上的進(jìn)一步改進(jìn)，使卵白素與鏈霉〔而非生物素〕結(jié)合，而后再結(jié)合PO基。

免疫組化原理及流程介紹1〕參加SP復(fù)合液后放入37度烤箱中30min。2〕用PBS洗5次×5min。具體操作：SP染色法的特點(diǎn):靈敏特異性低，本錢低。免疫組化原理及流程介紹8.顯色

在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化學(xué)基團(tuán)的顯色作用，是復(fù)合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。免疫組化原理及流程介紹通常在過氧化物酶〔HRP〕法中，顯色劑為DAB。DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法:DAB50mg0.05MTB100ml30%H2O230-40ulABC法SP法PAP法免疫組化原理及流程介紹9、復(fù)染、脫水、透明、封片復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用的試劑為蘇木素。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒〔一定動(dòng)作要快〕后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍(lán)即可。1)用PBS3次×3min后，用雙蒸水洗5min；加一大滴蘇木素染液，〔胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20s〕，自來水沖洗，雙蒸水洗5min，再用PBS返藍(lán)5min。2)脫水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol〔1-2〕min；95%ethanol〔1-2〕min；100%absoluteethanol:(1-2)min；100%absoluteethanol:(1-2)min。3)透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min4)封片：中性樹膠。免疫組化原理及流程介紹免疫組化原理及流程介紹四免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的判斷原那么：1.必須設(shè)對(duì)照。2.抗原表達(dá)必須在特定部位。3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。免疫組化原理及流程介紹實(shí)驗(yàn)分析的相關(guān)介紹陽(yáng)性對(duì)照：用抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對(duì)照切片呈陽(yáng)性結(jié)果，標(biāo)為陽(yáng)性對(duì)照。用確證不含抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。其實(shí)這只是陰性對(duì)照中的一種，陰性對(duì)照還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實(shí)驗(yàn)。陰性對(duì)照：免疫組化原理及流程介紹陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照替代對(duì)照實(shí)驗(yàn)組結(jié)論1－－－－操作錯(cuò)誤2＋＋＋＋非特異性反應(yīng)3＋＋－－陰性對(duì)照含定位Ag4－－－＋陰性對(duì)照不含定位Ag5＋－＋＋受檢組織非特異性染色6＋－－－受檢組織不含定位Ag7＋－－＋受檢組織含定位Ag免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果分析表免疫組化原理及流程介紹從表上可以看出，只有6，7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1～5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否認(rèn)Ab的特異性或因IHC技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用Ab.陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照替代對(duì)照實(shí)驗(yàn)組結(jié)論6＋－－－受檢組織不含定位Ag7＋－－＋受檢組織含定位Ag免疫組化原理及流程介紹1．陽(yáng)性染色特點(diǎn)①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性?！卜翘禺愋匀旧?xì)胞與組織無(wú)區(qū)別〕②染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一〔非特異性染色彌散性均勻〕?！锍鲜鰧?duì)照結(jié)果分析之外，還必須從以下幾個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)：2．組織切片制作過程的影響①固定不良—非特異性染色，顯示不均。②邊緣枯燥—非特異性染色〔常見〕，加抗體時(shí)勿干片。免疫組化原理及流程介紹3．人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一平面上。免疫組化原理及流程介紹▲染色失敗的幾種原因：(1)所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)。染色失敗的可能情況(2)所有切片均呈陽(yáng)性反響(3)所有切片背景過深(4)陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反響免疫組化原理及流程介紹(1)所有切片呈陰性1）染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行

2）漏加一種抗體，或抗體失活3）緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性4）底物中所加H2O2

量少或失活5）復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)免疫組化原理及流程介紹①切片在染色過程中抗體過濃，或干片了。緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底。使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反響時(shí)間過長(zhǎng)。④抗體溫育的時(shí)間過長(zhǎng)。⑤H2O2

濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚?！?〕所有切片呈陽(yáng)性反響，其原因：免疫組化原理及流程介紹（3）所有切片背景過深①內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷②切片或涂片過厚③漂洗不夠④底物呈色反應(yīng)過久⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血⑥使用全血清抗體稀釋不夠免疫組化原理及流程介紹〔4〕陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反響。

最常見的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)1.蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其要考慮陽(yáng)性染色的位置。2.切片脫蠟和水化要充分；加反響液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片。免疫組化原理及流程介紹本卷須知：3.以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻：①脫蠟不充分?？梢?0℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中；②水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；④抗體孵育時(shí)，切片放傾斜；⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。⑥制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。免疫組化原理及流程介紹4.一抗的清洗：免疫組化原理及流程介紹〔1