實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)印跡/免疫印跡Westernblotting/Immunoblotting基本操作流程提取組織或細(xì)胞蛋白，蛋白含量測定制備SDS凝膠蛋白質(zhì)變性，電泳分離蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)膜封閉，加一抗清洗，加二抗清洗，底物顯色（曝光）結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)時間安排

1.SDS膠制備

2.樣品蛋白質(zhì)含量測定

3.電泳4.提取小鼠基因組DNA

1.轉(zhuǎn)移電泳

2.蛋白質(zhì)膠考馬斯亮藍(lán)染色分析

3.膜封閉

4.加一抗（過夜溫浴4℃）

1.洗膜、考馬斯亮藍(lán)染色膠脫色

2.加酶標(biāo)二抗（溫浴37℃，1h）3.洗膜與顯示4.結(jié)果分析第一天第二天第三天

實(shí)驗(yàn)原理第一部分：1.SDS（polyacrylamidegelelectrophoresis）CH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOAcrylamideN,N'-MethyleneBisacrylamide[CH2CH]nCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHO[CH2CH]nCNH2O[CH2CH]nCNH2O[CH2CH]nCNH2O[CH2CH2CHCNHOCH2CNHOCH2CHpolyacrylamide

實(shí)驗(yàn)原理SDS濃度與分離蛋白質(zhì)范圍丙烯酰胺濃度（％）線性分離范圍（kD）1510~431212~601020~807.536~945.057~212

實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理第一部分：SDS電泳2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表現(xiàn)出不同的電荷；為使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，上樣前應(yīng)進(jìn)行處理，即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的上樣緩沖液。經(jīng)高溫處理，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，形成棒狀結(jié)構(gòu)，同時使整個蛋白帶上負(fù)電荷，電泳時凝膠中所含的SDS負(fù)電荷多肽復(fù)合物向正極泳動。

實(shí)驗(yàn)原理第一部分：SDS電泳3.蛋白樣品處于pH6.8壓縮膠的上層，pH8.8的分離膠層在下層。由于pH不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)，在濃縮膠泳動時，Pro-受阻小，在慢離子（Gly-）和快離子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白質(zhì)可在壓縮膠上被壓縮成一薄層，使全部蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠前位于同一“起跑線”上；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時，不同蛋白以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開。

實(shí)驗(yàn)原理第二部分：樣品的印跡（轉(zhuǎn)膜）1.選擇適當(dāng)?shù)哪げ⑦M(jìn)行預(yù)處理：

NC膜的預(yù)處理：剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1×轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡，使NC膜得到徹底浸潤，一般5分鐘以上。

PVDF膜的預(yù)處理：剪裁與膠大小一致的膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。膜的選擇PVDF膜硝酸纖維素膜

0.45um和0.2um孔徑

簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特點(diǎn)蛋白較硝酸纖維膜的結(jié)合能力強(qiáng)背景較NC膜深洗脫抗體后可再使用

實(shí)驗(yàn)原理第二部分：樣品的印跡（轉(zhuǎn)膜）2.電流1mA-2mA/cm2，通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間。目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉(zhuǎn)移時間（h）801408%1.52.0258010%1.5154012%0.75﹤2015%0.5

實(shí)驗(yàn)原理第三部分：特異抗體與抗原（靶蛋白）結(jié)合、顯色轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡(blot),用于對蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。封閉后，用針對目的蛋白的特異抗血清（一抗）處理，印跡中只有待研究的目的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合。清洗后，再用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理（二抗是指抗一抗的抗體），與適當(dāng)?shù)孜锶芤悍磻?yīng)后即可產(chǎn)生可見區(qū)帶，指示目的蛋白的位置。WesternBlotting化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光，X光膠片曝光顯影結(jié)果實(shí)驗(yàn)操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS,SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis1.膠模準(zhǔn)備與灌膠：取制膠玻板，平板、凹板各一；平板板平置桌面，左右和底部各放一塑料墊條（為防止膠液泄漏，可以在塑料墊條的兩面都涂上一層薄薄的凡士林）；然后蓋上凹板，底部對齊,左右和底部三側(cè)用夾子夾緊，直立于桌面上。實(shí)驗(yàn)操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS,SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis1.膠模準(zhǔn)備與灌膠：配分離膠：取一個250ml燒杯，加入以下成分:

分離膠緩沖液（pH8.8）2.5ml40%丙烯酰胺膠液2.5mlH2o4.9ml10%過硫酸銨0.1ml輕搖混勻后，8μLTEMED，再次混勻后立即加入玻板中。P.174.表21-1，小膠10ml/塊實(shí)驗(yàn)操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.膠模準(zhǔn)備與灌膠：灌入膠模，至距膠頂約1.5cm（制膠模具不同，分離膠高度有區(qū)別，一般為梳齒前沿至膠面約1～1.5cm）；徐徐加入0.5-1ml水覆蓋膠頂。室溫放置待膠凝聚（約需30分鐘），其間配壓縮膠。實(shí)驗(yàn)操作一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.膠模準(zhǔn)備與灌膠：壓縮膠配制

壓縮膠緩沖液（pH6.8）1ml40%丙烯酰胺膠液0.5mlH2o2.5ml10%過硫酸銨40μL輕搖混勻后，加入4μLTEMED，再次搖勻后灌入膠模待分離膠與上面的水層之間的界限由清晰逐漸消失，又重新出現(xiàn)后，傾去上層水，用濾紙吸干；向壓縮膠混合液中加入4μLTEMED，立即搖勻，灌入膠模至距膠頂約0.5cm；徐徐插入上樣梳，勿留任何氣泡于膠液中；放置1小時以上。P.174.表21-1，小膠4ml/塊實(shí)驗(yàn)操作二、Bradford法蛋白質(zhì)含量測定:取7只試管，按以下順序加入各種試劑：管號空白12345血清樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白mL(Conc.1mg/mL)01020304050樣品mL------2（鼠）2（兔）0.15MNaClmL300290280270260250298298向每只管中各加入顯色試劑3ml，立即混勻，放置10min后，于分光光度計(jì)上，595nm比色測定OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，作圖求出血清中蛋白質(zhì)的濃度。V樣品體積:V工作液體積=1:10實(shí)驗(yàn)操作三、電泳樣品制備

分別各取取含200μg、20μg蛋白質(zhì)的鼠血清放入兩只1.5ml離心管中，再取200μg兔血清放入一只1.5ml離心管中（陰性對照），200μg樣品管根據(jù)定量結(jié)果，加生理鹽水稀釋至其濃度為：6-8μg/μL，20μg樣品管加生理鹽水至與200μg管等體積。分別加相應(yīng)體積的4×SDS電泳上樣緩沖液（4×Loadingbuffer），混勻；95℃加熱10min。實(shí)驗(yàn)操作四、電泳模具裝配膠凝后，去除夾子和墊條；將電泳儀的下槽中注滿電極液，將膠模的凹板板面向電泳儀的支架，插入電泳儀下槽；用大夾子將膠模上部與支架夾緊；向電泳儀上槽中加入電極液，至沒過短玻板上緣1cm；觀察上槽液有無泄漏。無泄漏時，拔除上樣梳，整理上樣井。實(shí)驗(yàn)操作五、上樣向上樣井中順序加入樣品，鼠血清總蛋白50μg、10μg；兔血清總蛋白50μg、10μg；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物6μL；預(yù)染色的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物5μL。一份用于蛋白印跡分析，一份用于染色分析。Pre-stainedproteinmolecularladder10μg50μg兔血清總蛋白10μg50μg鼠血清總蛋白10μg50μg兔血清總蛋白10μg50μg鼠血清總蛋白Pre-stainedproteinmolecularladder實(shí)驗(yàn)操作六、電泳將電泳電源與電泳儀用導(dǎo)線相連，負(fù)極接上槽，正極接下槽；按壓縮膠80V，分離膠10V過夜電泳。實(shí)驗(yàn)操作第二部分轉(zhuǎn)移電泳（TransferElectrophoresis）

1.電轉(zhuǎn)移準(zhǔn)備（濕轉(zhuǎn)）：盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的塑料盤中，按順序浸入墊網(wǎng)，二張濾紙(與墊網(wǎng)同大)，剪一與分離膠同大的硝酸纖維素膜，先讓其漂在液面上，待液體浸透膜，無任何白斑后，讓液體沒過膜，再浸入二層濾紙和一層墊網(wǎng)。

2.轉(zhuǎn)移夾裝配：

向轉(zhuǎn)移電泳儀中注入轉(zhuǎn)移電泳緩沖液至三分之一高度；盛有轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的塑料盤中，將轉(zhuǎn)移夾板打開，夾板的一扇板平置入塑料盤中，另一扇板直立；然后按順序逐層移入一層墊網(wǎng)和兩層濾紙，層間不可留有氣泡；

實(shí)驗(yàn)操作第二部分轉(zhuǎn)移電泳（TransferElectrophoresis）

電泳完畢，取下電泳膠模，將有耳玻板面向下平置桌面上，向下端兩玻板間插入刀片將玻板分開；用刀片切去壓縮膠，再將分離膠從中分為兩半，一半用于電轉(zhuǎn)移一半用于考馬斯亮藍(lán)染色（參見附1）；將膠平放在濾紙的中央，其與濾紙之間不可留氣泡；再順序逐層覆蓋上硝酸纖維素膜，二層濾紙和墊網(wǎng)；扣上轉(zhuǎn)移夾，將其夾扣位于上方插入轉(zhuǎn)移電泳槽中，注意令硝酸纖維素膜所在一側(cè)對向紅色接線柱，絕不可顛倒。NC膜濾紙濾紙SDS濾紙濾紙＋－SDSNC膜實(shí)驗(yàn)操作第三部分酶標(biāo)免疫反應(yīng)顯示

Immuno-detectionofProteinBlotswithHRP-labeledAntibody1.蛋白轉(zhuǎn)移膜的麗春紅染色顯示：（使用預(yù)染Marker此步驟可省略）

轉(zhuǎn)移電泳完畢，斷電，取出轉(zhuǎn)移夾，取出轉(zhuǎn)印膜于20ml蒸餾水中漂洗一遍，然后用10ml麗春紅染液（0.2%麗春紅-1%乙酸）染1min；用蒸餾水漂洗至背景近白色，漂洗應(yīng)少量多次，每次30ml左右；照相留底；繼續(xù)用蒸餾水漂洗至色帶消失或者基本消失。實(shí)驗(yàn)操作第三部分酶標(biāo)免疫反應(yīng)顯示2.封閉加入封閉液（5%脫脂奶粉TBST溶液或3%BSATBST溶液），以液體展開后剛剛沒過膜表面為宜，室溫下置搖床1h；3.加入適量一抗（根據(jù)抗體說明書確定相應(yīng)用量），4℃搖床過夜；4.取出膜條，TBST徹底清洗一抗，加入酶標(biāo)二抗，37℃保溫1h。實(shí)驗(yàn)操作第三部分酶標(biāo)免疫反應(yīng)顯示5.顯色檢測：根據(jù)酶標(biāo)所用酶選用適當(dāng)?shù)娘@示方法。本實(shí)驗(yàn)采用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，相應(yīng)地采用氯萘酚成色顯示方法。傾去含酶標(biāo)抗體的封閉液，用TBS漂洗硝酸纖維素膜3遍，各振搖5分鐘；蒸餾水漂洗1遍，漓去水后在顯色液中顯色，輕輕振搖至顯色深度不再增加，然后放入水中漂洗停止顯色，照相存底，移到濾紙上干燥保存。小鼠基因組DNA的制備

(PreparationofGenomicDNA)1.肝組織的消化取100-200mg肝臟，用剪刀剪碎，移入7ml離心管中，加入2ml消化緩沖液，混勻。再加入20μl蛋白酶K，蓋緊管蓋，充分顛倒混勻。置50℃水浴箱中，過夜。第一天操作步驟2.加入2ml苯酚：氯仿，蓋緊管蓋，振蕩器上劇烈震蕩30秒，12000rpm，10min。3.取上層水相1ml轉(zhuǎn)移入一只新的7ml的離心管中，加入1/2體積（0.5ml）的7.5M乙酸銨，混勻；再加入2體積（3ml）的無水乙醇，顛倒混勻，12000rpm，10min。4.去上清，加入1ml70%乙醇清洗沉淀，離心1min。5.去上清，干燥后加入200μlTE溶液，-20℃凍存?zhèn)溆?。第二天操作步驟附1：SDS考馬斯亮藍(lán)染色顯示方法1.染色（Staining）：加入5倍體積的染色液，于搖床上振搖2小時。2.脫色（Destaining）：傾去染色液，加入5體積脫色液，于搖床上振搖至背景脫凈（其間至少更換3次脫色液），照相保存結(jié)果。4.干膠保存（GelDrying）：取玻璃板，裁取兩張比玻璃板長出和寬出5-6cm的玻璃紙，浸泡入水中10分鐘。然后于玻璃板上鋪一張浸泡過的玻璃紙，每邊超出框架3cm左右，將膠塊置中間；再覆蓋上一張浸泡過的玻璃紙，注意勿在膠塊與玻璃紙之間留存氣泡，最后將每邊長出的玻璃紙翻向玻璃板下方卷折，四周用