赤潮中的毒力學(xué)檢測(cè)研究進(jìn)展

“赤潮毒素”通常被稱(chēng)為“堿性毒素”或“堿性毒素”。隨著赤潮的頻繁發(fā)生,有毒赤潮藻被魚(yú)或貝類(lèi)食用后,在體內(nèi)積累,人食用含有大量赤潮毒素的魚(yú)或貝類(lèi)后,會(huì)引起中毒,嚴(yán)重者甚至死亡。因此,實(shí)現(xiàn)赤潮毒素快速、高效、高靈敏檢測(cè)和預(yù)報(bào)已成為確保水產(chǎn)品安全及人體健康迫切解決的問(wèn)題。對(duì)于赤潮毒素,雖然各國(guó)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不同,但是隨著人們對(duì)食品安全的重視和赤潮毒素研究的不斷深入,海產(chǎn)品赤潮毒素限制量標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越高,這就意味著對(duì)赤潮毒素檢測(cè)手段提出新的挑戰(zhàn)。赤潮毒素早期檢測(cè)是采用小鼠生物毒性分析方法,隨著分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,免疫學(xué)檢測(cè)方法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等被應(yīng)用到赤潮毒素檢測(cè)中,大大提高了其檢測(cè)的速度和靈敏度。目前已經(jīng)檢測(cè)報(bào)道的赤潮毒素根據(jù)其對(duì)人類(lèi)引發(fā)的中毒癥狀可分為記憶缺失性貝毒(AmnesicShellfishPoisoning,ASP),麻痹性貝毒(ParalyticShellfishPoisoning,PSP),腹瀉性貝毒(DiarrheicShellfishPoisoning,DSP),神經(jīng)性貝毒(NeurotoxicShellfishPoisoning,NSP)、西加魚(yú)毒(CiguateraFishPoisoning,CFP)等。既有水溶性化合物,也有脂溶性化合物。根據(jù)其自身的理化特性選擇合適的檢測(cè)手段是保證赤潮毒素高效、高靈敏檢測(cè)的前提條件。在本文中,我們將對(duì)基于典型赤潮毒素的不同檢測(cè)方法及其在提高檢測(cè)靈敏度方面進(jìn)行綜述。1赤潮毒素檢測(cè)技術(shù)1.1赤潮毒素檢測(cè)小鼠生物毒性檢測(cè)法是將含有赤潮毒素的提取液注射到小鼠體內(nèi),通過(guò)比較小鼠的存活時(shí)間和中毒癥狀對(duì)赤潮毒素的毒性及含量進(jìn)行評(píng)估。此方法能夠直接體現(xiàn)生物對(duì)毒素反應(yīng),通常作為毒性前期判斷和其它檢測(cè)方法的參比試驗(yàn)?，F(xiàn)階段我國(guó)進(jìn)出口海產(chǎn)品檢測(cè)PSP、DSP和NSP貝毒仍然保留小鼠生物毒性檢測(cè)法。但是此方法靈敏度較低,檢出限高,通常用來(lái)定性檢測(cè)貝毒的毒性大小,難以確定其成分和含量。1.2elisa檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)法由于具有選擇性強(qiáng)、檢出限低、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),該方法在檢測(cè)赤潮毒素方面一直為研究熱點(diǎn)。目前,免疫學(xué)檢測(cè)赤潮毒素最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),其核心反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)。赤潮毒素免疫學(xué)檢測(cè)法主要以多克隆抗體或單克隆抗體識(shí)別有毒細(xì)胞表面特異性抗原為基礎(chǔ)。由于大部分赤潮毒素分子很小,本身沒(méi)有免疫原性,需先與蛋白質(zhì)載體結(jié)合獲得免疫原性,成為完全抗原,再對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫,產(chǎn)生高特異性的多克隆抗體。Naar等將短裸甲藻毒素與血藍(lán)蛋白結(jié)合,免疫山羊得到短裸甲藻毒素多克隆抗體,利用抗原抗體反應(yīng),建立短裸甲藻毒素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,對(duì)帶刺的牡蠣中短裸甲藻毒素檢出限為2.5μg/100g肉。許道艷等將DA偶聯(lián)到蛋白載體上,數(shù)次免疫BALB/c小鼠,得到抗DA的多克隆抗血清,以DA-卵清白蛋白(OVA)為包被抗原,利用抗原抗體反應(yīng),建立記憶缺失性貝毒間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,用以分析檢測(cè)海水樣品和海洋貝類(lèi)中的記憶缺失性貝毒,檢出限為10μg/L。單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、對(duì)樣品處理要求低等優(yōu)點(diǎn),一直是海洋赤潮毒素檢測(cè)非常有價(jià)值的探針。2002年,Kawatsu等利用雜交瘤技術(shù)制備抗麻痹性貝毒素GTX2,3單克隆抗體,采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù),對(duì)麻痹性貝毒素GTX2,3檢測(cè)限達(dá)到0.15ng/mL。2009年,Zhou等報(bào)道了一種簡(jiǎn)單、快速制備抗記憶缺失性貝毒(DA)單克隆抗體的方法,他們利用BALB/c小鼠的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,分離雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi),降低單克隆抗體制備過(guò)程中所需抗原量(僅用70μg/mouse),減小免疫時(shí)間短(<16d)。采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù),在磷酸鹽為緩沖溶液中對(duì)DA檢測(cè)限達(dá)到0.41ng/well。酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng),敏感性高,分析速度快,不需要昂貴的設(shè)備,已廣泛應(yīng)用于ASP,PSP,DSP,NSP等赤潮毒素的檢測(cè)。1.3不同赤潮毒素的檢測(cè)根據(jù)赤潮毒素的結(jié)構(gòu)特征,高效液相色譜(HPLC)分別與紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器聯(lián)合測(cè)定不同赤潮毒素。目前幾種典型的赤潮毒素都有關(guān)于HPLC檢測(cè)方法的報(bào)道。1.3.1軟骨藻酸的提取和預(yù)富集研究紫外檢測(cè)法具有無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生,分析速度快,便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),Lawrence等最早利用該方法檢測(cè)記憶缺失性貝毒,記憶缺失性貝毒的主要成分是軟骨藻酸(DA),軟骨藻酸分子含有共軛雙鍵,在242nm處具有最大吸收值。他們利用0.1mol/LHCl從貝類(lèi)組織中粗提取軟骨藻酸,使用C18反相色譜柱和酸性流動(dòng)相,對(duì)提取液進(jìn)行HPLC-UV檢測(cè),DA的檢出限為1μg/g。紫外檢測(cè)背景干擾大,分析靈敏度較低,為提高檢測(cè)靈敏度,Quilliam等采用50%甲醇-水溶液快速提取軟骨藻酸,然后利用強(qiáng)陰離子交換固相萃取進(jìn)行預(yù)富集,HPLC-UV檢測(cè)軟骨藻酸,檢出限為20～30ng/g。Llorca-Porcel等將大體積(100μL)試樣引入色譜柱,樣品采用0.15%的三氟乙酸酸化,梯度洗脫紫外檢測(cè)軟骨藻酸,檢出限達(dá)到42pg/mL。1.3.2柱后衍生法檢測(cè)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法的關(guān)鍵是根據(jù)待測(cè)物質(zhì)選擇合適熒光試劑。為提高檢測(cè)靈敏度,記憶缺失性貝毒主要成分軟骨藻酸通常用4-氟-7-硝基苯并呋喃(4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan,NBD-F)或4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑(4-Chloro-7-nitrobenzofurazan,NBD-Cl)進(jìn)行衍生。NBD-F具有快速標(biāo)記伯胺和仲胺功能,衍生化合物的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為470nm和530nm。NBD-Cl可以快速標(biāo)記仲氨,衍生化合物的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為464nm和512nm。麻痹性貝毒(PSP)分子本身生色基團(tuán)很弱,不能直接用紫外或熒光檢測(cè),但其分子的環(huán)結(jié)構(gòu)在堿性條件下極易氧化開(kāi)環(huán),生成熒光基團(tuán),可進(jìn)行熒光檢測(cè)。根據(jù)氧化衍生手段可分為柱前衍生和柱后衍生。Lawrence等利用過(guò)氧化氫和高碘酸柱前氧化麻痹性貝毒。氧化產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為330nm,發(fā)射波長(zhǎng)為400nm。陳迪等利用2%堿性過(guò)氧化氫進(jìn)行柱前衍生,以乙腈-0.1mol/L甲酸銨溶液(5:95,V/V)作流動(dòng)相,C18色譜柱分離,對(duì)石房蛤毒素(STX)和脫氨甲?；扛蚨舅?dcSTX)檢出限分別為1.0ng/g和0.3ng/g。HPLC柱后衍生熒光測(cè)定PSP法是已被廣泛報(bào)道,且已成為PSP檢測(cè)的主要儀器分析方法。1999年,Boyer等采用HPLC柱后衍生測(cè)定麻痹性貝毒,以磷酸鹽緩沖溶液(pH9)為流動(dòng)相,提取液中的麻痹性貝毒在堿性條件下利用高碘酸氧化,氧化后再用0.5mol/L的醋酸酸化生成熒光物質(zhì)。2006年,江天久等以9.0mmol/L磷酸銨緩沖溶液(含有2.8mmol/L庚烷磺酸鈉)作為流動(dòng)相,采用梯度改變乙腈在流動(dòng)相中的比例和流速,柱后衍生法實(shí)現(xiàn)麻痹性病毒GTX/neo-STX/dcSTX/STX同時(shí)測(cè)定。柱后衍生法通常在色譜分離柱的后面加一個(gè)氧化反應(yīng)柱,具有操作簡(jiǎn)單,可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn),但是此方法氧化反應(yīng)對(duì)色譜流速、溫度、pH值及反應(yīng)時(shí)間要求苛刻,在最優(yōu)化條件下,反應(yīng)生成的熒光衍生物才能被檢測(cè)出來(lái)。腹瀉性貝毒(DSP)的熒光衍生試劑通常是9-蒽基疊氮甲烷9-Anthryldiazomethane(ADAM),最大吸收波長(zhǎng)365nm,發(fā)射波長(zhǎng)415nm。Mouratidou等通過(guò)硅膠固相萃取提純腹瀉性貝毒—大田軟海綿酸(OA),并利用ADAM離線(xiàn)衍生,反向液相色譜熒光檢測(cè),對(duì)OA的檢出限為0.14ng/20μL。由于ADAM在常溫下不穩(wěn)定,實(shí)用廣泛性受到限制,許多研究者嘗試著用其它衍生劑,Shen等利用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(4-bromomethyl-7methoxycoumarin,BrMmc)柱前衍生腹瀉性貝毒,經(jīng)等度洗脫,檢出限為0.05mg/kg。1.4高效液相質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜法(MS)檢測(cè)赤潮毒素通常采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集成了色譜的高分辨能力與質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),不僅可以測(cè)定赤潮毒素的含量和組分,而且可以提供化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。目前,已成為分離和鑒定貝毒的重要手段。1994年,Lawrence等將樣品經(jīng)甲醇-水提取DA,強(qiáng)陰離子或陽(yáng)離子固相萃取純化,嘗試?yán)酶咝б合嗌V-電噴霧質(zhì)譜法檢測(cè)DA,檢出限為0.1μg/g。為簡(jiǎn)化試樣預(yù)處理過(guò)程,提高檢測(cè)靈敏度,2001年,Furey等利用液相色譜三級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)DA,鑒定結(jié)構(gòu)信息,一級(jí)質(zhì)譜的檢出限為0.02μg/mL,二級(jí)質(zhì)譜的檢出限為0.014μg/mL,三級(jí)質(zhì)譜的檢出限為0.008μg/mL。對(duì)于麻痹性貝毒的檢測(cè),2004年,Fang等利用高效液相-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)麻痹性貝毒組分dcSTX和STX。樣品采用0.1mol/LHCl超聲提取,C18色譜柱固相萃取,以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫,正離子電噴霧離子模式下檢測(cè)dcSTX(m/z257)和STX(m/z300),結(jié)果顯示樣品加標(biāo)的平均回收率為84%～92%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8%～14%,檢測(cè)限為0.1μg/g。2009年,These等基于固相萃取技術(shù)對(duì)大田軟海綿酸、扇貝毒素、原多甲藻酸、蝦夷扇貝毒素等4種腹瀉性貝毒進(jìn)行提純富集,富集倍率為10,利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析,檢測(cè)限為1μg/kg。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)于油脂性毒素(如DSP、NSP、CFP),流動(dòng)相的pH值影響色譜分離行為,進(jìn)而影響不同毒素的分離度和檢測(cè)靈敏度。2009年,Gerssen等利用LC-MS/MS法分離和檢測(cè)腹瀉性貝毒,用含有氨水的乙腈/水溶液(pH11)作為流動(dòng)相梯度洗脫,一次可以分析28個(gè)不同的親油性赤潮毒素。由于在堿性條件下油脂性毒素穩(wěn)定,OA/YTX/GYM/SPX1檢出限比酸性溶液梯度洗脫條件下提高2～3倍。隨著質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的成熟和不斷完善,該技術(shù)將成為赤潮毒素檢測(cè)的有力手段。1.5毛細(xì)管電泳檢測(cè)1999年,Pineiro等對(duì)毛細(xì)管電泳分離電壓、緩沖溶液濃度、管壁修飾等因素進(jìn)行優(yōu)化,利用紫外二極管陣列檢測(cè)麻痹性貝毒和記憶缺失性貝毒。對(duì)dcSTX、STX和DA檢出限分別為0.06μg/mL、0.05μg/mL和0.75μg/mL。2007年,陳曉燕等建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳紫外檢測(cè)膝溝藻毒素GTX2和GTX3的方法,以磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液,GTX2,GTX3線(xiàn)性范圍分別為0.5μmol/L～118.0μmol/L和0.5～39.0μmol/L,檢測(cè)限分別為0.38μmol/L和0.36μmol/L(S/N≥3)。赤潮毒素含量低,且毛細(xì)管內(nèi)徑小,有效光程短,所以毛細(xì)管電泳測(cè)定赤潮毒素關(guān)鍵是提高毛細(xì)管電泳檢測(cè)靈敏度,目前常采用在線(xiàn)預(yù)富集方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。Locke等利用毛細(xì)管等速電泳-區(qū)帶電泳-紫外(CITP/CZE/UV)檢測(cè)麻痹性貝毒,首先利用等速電泳對(duì)試樣在線(xiàn)預(yù)富集,然后進(jìn)行區(qū)帶電泳分離,通過(guò)等速電泳預(yù)富集使檢出限降低2個(gè)數(shù)量級(jí),對(duì)STX和neo-STX檢出限為10nmol/L,對(duì)GTX2,3毒素檢出限20nmol/L(S/N=3)。2006年,Wu等在分離電壓、緩沖溶液的濃度、pH值等優(yōu)化條件下,利用毛細(xì)管等速電泳基線(xiàn)分離dcSTX/STX/NEO/GTX-2/GTX-3/GTX-1/GTX-4等7種麻痹性貝毒,峰面積是毛細(xì)管區(qū)帶電泳的20倍,對(duì)麻痹性貝毒檢測(cè)線(xiàn)性范圍為1.3～200μmol/L,檢出限為0.1～0.3μmol/L(S/N=3)。2007年,delaIglesia等采用大體積試樣引入在線(xiàn)預(yù)富集方法,利用CE-UV和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)-UV兩種模式檢測(cè)YTX,對(duì)于YTX檢出限分別為0.3μg/mL和0.2μg/mL。毛細(xì)管電泳目前常用紫外檢測(cè)方法,為提高檢測(cè)靈敏度,也可采用高靈敏檢測(cè)技術(shù),如與質(zhì)譜聯(lián)用或激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè)。Locke等將毛細(xì)管等速電泳在線(xiàn)預(yù)富集技術(shù)與質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)用分析麻痹性貝毒。對(duì)STX和neo-STX檢出限為16nmol/L,對(duì)GTX毒素的檢出限為30nmol/L(S/N=3)。delaIglesia等采用場(chǎng)強(qiáng)放大方式對(duì)試樣進(jìn)行堆積,利用CE-MS檢測(cè)YTX,檢出限達(dá)到0.02μg/mL。Shea等利用MEKC-LIF方法檢測(cè)神經(jīng)性貝毒,以7-甲氧基香豆素-3-羧基酸(7-methoxycoumarin-3-carbonylazide)為衍生試劑,最大吸收波長(zhǎng)354nm,發(fā)射波長(zhǎng)410nm,檢出限達(dá)到4pg/g。2新技術(shù)的發(fā)展當(dāng)前每種赤潮毒素的檢測(cè)方法都有自身的優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)一步完善的必要。例如,小鼠生物毒性檢測(cè)法能夠反映赤潮毒素的實(shí)際毒性,但測(cè)定過(guò)程中需要大量毒素,且靈敏度低;免疫學(xué)檢測(cè)方法特異性強(qiáng),敏感性高,分析速度快,一些相關(guān)毒素的試劑盒已經(jīng)上市,但目前試劑盒價(jià)格昂貴;HPLC法及HPLC-MS法能夠精確地定量測(cè)定赤潮毒素,具有很好的發(fā)展前景,但是樣品前處理復(fù)雜,儀器使用成本高,測(cè)試人員需要專(zhuān)門(mén)培訓(xùn);毛細(xì)管電泳法具有實(shí)際消耗量少、分析速度快、便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),也是極具有發(fā)展?jié)摿Φ姆治龇椒?但是毛細(xì)管內(nèi)徑小,有效光程短,提高毛細(xì)管電泳檢測(cè)靈敏度為技術(shù)關(guān)鍵之一。近年來(lái),隨著人們對(duì)赤潮研究的進(jìn)一步深入,新的檢測(cè)手段不斷改進(jìn)。在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,又有一些新的檢測(cè)方法被發(fā)展。如:(1)表面等離子體共振法(surfacePlasmonresonance,SPR),它是一種基于表面折射系數(shù)改變的光學(xué)分析技術(shù)。由于SPR對(duì)金屬表面折射率的變化非常敏感,反應(yīng)物固定在金屬膜上,被分析樣品通過(guò)金屬膜時(shí)與反應(yīng)物相互作用而引起金屬膜表面