關(guān)于微生物學(xué)第八章微生物與基因工程基因工程是指對遺傳信息的分子操作和施工。即把分離的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴增和表達(dá)，從而獲得大量的基因產(chǎn)物或者令生物表現(xiàn)出新的性狀。其核心是構(gòu)建重組體DNA技術(shù)。簡單地說基因工程就是運用重組DNA技術(shù)改造生物的性狀。第2頁,共76頁，2024年2月25日，星期天基因工程是一種DNA的體外重組技術(shù)，是根據(jù)人們的需要，在分子水平上用人工方法取得供體DNA上的基因，在體外重組于載體DNA上，再移入原體細(xì)胞，使轉(zhuǎn)錄翻譯及復(fù)制，表達(dá)出供體基因原有的生物學(xué)特性。這種使DNA分子進行重組，再在受體細(xì)胞內(nèi)無性繁殖的技術(shù)也被稱為分子無性繁殖或分子克隆、重組DNA技術(shù)。

通過基因工程改造后的菌株被稱為“工程菌”。第3頁,共76頁，2024年2月25日，星期天基因工程是一門嶄新的生物技術(shù)。它的出現(xiàn)標(biāo)志著人類已經(jīng)能夠按照自己意愿進行各種基因操作，大規(guī)模生產(chǎn)基因產(chǎn)物，并可設(shè)計和創(chuàng)建新的蛋白質(zhì)和新的生物物種。第4頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA的特異切割、DNA分子克隆、DNA快速測序這三項技術(shù)的建立為基因工程奠定了基礎(chǔ)。第5頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

微生物與基因工程的關(guān)系

微生物與基因工程的關(guān)系密切，基因工程的產(chǎn)物和發(fā)展依賴于微生物學(xué)的理論和技術(shù)。微生物在基因工程中的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用?？梢哉f一切基因工程操作都離不開微生物。

第6頁,共76頁，2024年2月25日，星期天①基因工程所用載體不是微生物就是微生物的質(zhì)粒。

②基因工程所用的千余種工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化得到的。

③微生物細(xì)胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和動物基因工程也要先構(gòu)建穿梭載體，使外源基因或重組體DNA在大腸桿菌中得到克隆并進行拼接和改造，才能再轉(zhuǎn)移到植物或動物細(xì)胞中。微生物和微生物學(xué)在基因工程中的重要性第7頁,共76頁，2024年2月25日，星期天④為了大規(guī)模表達(dá)各種基因產(chǎn)物，從事商業(yè)化生產(chǎn)，通常都是將外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌或者是酵母菌中以構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實現(xiàn)。

⑤微生物的多樣性，尤其是抗高溫、高鹽、高堿、低溫等基因，為基因工程提供了極其豐富而獨特的基因資源。

⑥有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達(dá)調(diào)控的理論主要是從微生物的研究中取得的，或者是將動物、植物基因轉(zhuǎn)移到微生物中后研究而獲得的。第8頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、

微生物與克隆載體克隆載體（cloningvector）：外源DNA片段進行克隆，需要一個合適的載體將其運送到細(xì)胞中并進行復(fù)制和擴增。這種以擴增外源基因為目的的載體稱為克隆載體。

把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進受體細(xì)胞中去進行繁殖和表達(dá)的工具叫載體（vector）。第9頁,共76頁，2024年2月25日，星期天作為克隆載體的條件是：①載體在細(xì)胞中必須能夠進行獨立自主地復(fù)制，因此載體應(yīng)是一個復(fù)制子；②載體必須具有若干個限制酶的單一切割位點，便于外源基因的插入。并且這些酶切位點應(yīng)位于載體復(fù)制的非必要去，故插入適當(dāng)大小外源DNA片段后載體仍能進行正常的復(fù)制。③載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記。如抗生素的抗性基因等。

第10頁,共76頁，2024年2月25日，星期天基因工程中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括6大類：質(zhì)粒載體；λ噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒載體；M13噬菌體載體；真核細(xì)胞的克隆載體；人工染色體等。第11頁,共76頁，2024年2月25日，星期天載體的選擇1）是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子（replicon)2)能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。3）載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。4）載體上必須有一種選擇遺傳標(biāo)記，以便及時將“工程菌”選擇出來。第12頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、質(zhì)?？寺≥d體（1）、質(zhì)粒載體質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，經(jīng)人工修飾改造后作為克隆載體具有十分有利的特性：①

具有獨立復(fù)制起點；②

具有較小的相對分子質(zhì)量，一般不超過15kb；③

具有較高拷貝數(shù)，使外源DNA得以大量擴增；④

易于導(dǎo)入細(xì)胞；⑤

具有便于選擇的標(biāo)記和具有安全性。第13頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價值的克隆載體，具有很多優(yōu)點：①

其分子遺傳學(xué)背景十分清楚；②

載體容量較大，一般質(zhì)粒載體只能容納10多個kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；③

具有較高的感染效率，其感染宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá)100%，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有0.1%。

但野生型λ噬菌體DNA的分子很大，基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，限制酶有很多切點，且這些切點多數(shù)位于必需基因之中，因而不適于作為克隆載體，必需經(jīng)一系列改造才能用作克隆載體。

構(gòu)建λ噬菌體載體克隆載體的基本原則是：①

刪除基因組中非必需區(qū)，使基因組變小，有利于克隆較大的DNA片段；②

除去多余的限制位點。

第14頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3、柯斯質(zhì)粒載體

柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvector）即粘粒載體，是由λ噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成?？滤官|(zhì)粒載體含有來自質(zhì)粒的一個復(fù)制起點、抗藥性標(biāo)記、一個或多個限制酶單一位點，以及來自λ噬菌體粘性末端的DNA片段，即cos位點，其對于將DNA包裝成λ噬菌體粒子是必需的。

柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)點：①

具有噬菌體的高效感染力，而在進入宿主細(xì)胞后不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在；②

具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式，重組DNA注入宿主細(xì)胞后，兩個cos位點連接形成環(huán)狀DNA分子，如同質(zhì)粒一樣進行復(fù)制；③

具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯質(zhì)粒本身一般只有5~7kb左右，而它可克隆外源DNA片段的極度限值竟高達(dá)45kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體及λ噬菌體載體的克隆能力。第15頁,共76頁，2024年2月25日，星期天4、M13噬菌體載體M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀ssDNA，大小為6407bp。感染雄性（F+或Hfr）大腸桿菌并進入細(xì)胞后轉(zhuǎn)變成復(fù)制型（RF）dsDNA，然后以滾環(huán)方式復(fù)制出ssDNA。每當(dāng)復(fù)制出單位長度正鏈，即被切出和環(huán)化，并立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細(xì)胞不被裂解）釋放至胞外。

野生型M13不適于直接作為克隆載體，因此人們對其進行改造，構(gòu)建了一系列M13克隆載體。第16頁,共76頁，2024年2月25日，星期天5、噬菌體質(zhì)粒載體

噬菌體質(zhì)粒（phagemid或phasmid）是由絲狀噬菌體和質(zhì)粒載體DNA融合而成，兼有兩者優(yōu)點，這類載體具有來自M13或f1噬菌體的基因間隔區(qū)（內(nèi)含M13或f1噬菌體復(fù)制起點）和來自質(zhì)粒的復(fù)制起點、抗藥性標(biāo)記、一個多克隆位點區(qū)等。噬菌體質(zhì)粒載體在應(yīng)用上具有許多優(yōu)點：①載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作；②克隆外源DNA容量較M13噬菌體載體大，可克隆10kb外源DNA片段；③可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外源基因。第17頁,共76頁，2024年2月25日，星期天6、真核生物的克隆載體真核生物載體，主要有以下幾大類：（1）、酵母質(zhì)粒載體①、附加體質(zhì)粒（epislmalplasmid）②、復(fù)制質(zhì)粒（replicatingplasmid）③、整合質(zhì)粒（integratingplasmid）

（2）、真核生物病毒載體①、哺乳動物病毒載體②、昆蟲病毒載體③、植物病毒載體第18頁,共76頁，2024年2月25日，星期天7、人工染色體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）是一類目前能容納最大外源DNA片段人工構(gòu)建的載體。酵母染色體的控制系統(tǒng)主要包括三部分：①

著絲粒（centromere,CEN），它的作用是使染色體的附著粒與有絲分裂的紡錘絲相連，保證染色體在細(xì)胞分裂過程中正確分配到子代細(xì)胞；②

端粒（telomere,TEL），位于染色體兩個末端，功能是保護染色體兩端，保證染色體的正常復(fù)制，防止染色體DNA復(fù)制過程中兩端序列的丟失；③

酵母自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）其功能與酵母細(xì)胞復(fù)制有關(guān)。第19頁,共76頁，2024年2月25日，星期天表達(dá)載體的構(gòu)建

基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌、酵母或動、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動、植物的遺傳性狀。所謂表達(dá)載體（expressionvector）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。也即克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)擴增；表達(dá)載體不僅可使外源基因擴增，還可使其表達(dá)。原核生物和真核生物的表達(dá)載體有一些共同的要求，但兩者的基因表達(dá)調(diào)控機制有很大不同，故需要分別采用原核生物和真核生物的調(diào)控原件來構(gòu)建。第20頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件包括：啟動子、核糖體的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止信號密碼子偏愛性等。第21頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開關(guān)的作用通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價值的外源蛋白可能對宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長；此外某些載體的啟動子是強啟動子，如T7啟動子，強啟動子的表達(dá)非常強以致使正常宿主基因不能表達(dá)。

基于以上事實，宿主細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個階段進行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價值的表達(dá)產(chǎn)物。在原核基因表達(dá)調(diào)控中，阻遏蛋白－操縱基因系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)開關(guān)的作用。當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因相結(jié)合時，能夠阻止基因的轉(zhuǎn)錄。加入誘導(dǎo)物，使其與阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄。第22頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、微生物與基因工程工具酶基因工程所用的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化獲得的。

對DNA片段進行操作，必須要有能“切短”DNA的得心應(yīng)手的工具。工具酶就是對不同來源的DNA片段進行切割拼接組裝。在分離目的基因或切割載體時，需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對DNA進行準(zhǔn)確切割。在構(gòu)建重組DNA時，需要DNA連接酶催化，使目的DNA片段與載體DNA進行連接。第23頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）或簡稱為限制性酶（restrictionenzyme）是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶.其作用是在分離目的基因或切割載體時對DNA進行準(zhǔn)確切割。如：大腸桿菌的EcoRⅠ，流感嗜血桿菌的HindⅢ，肺炎克雷伯氏桿菌的KpnⅠ等等。EcoRⅠ中E是大腸桿菌屬名的第一個字母，co是種名的頭兩個字母，R是株名，Ⅰ表示該菌第一個被分離出來的酶。第24頁,共76頁，2024年2月25日，星期天限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的作用

第25頁,共76頁，2024年2月25日，星期天同裂酶：有些來源不同的限制酶卻識別和切割相同的序列，這類限制酶稱為同裂酶。

同尾酶：有些來源不同的限制酶，識別和切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。

第26頁,共76頁，2024年2月25日，星期天將不同的DNA片段連接在一起的酶叫DNA連接酶。DNA連接酶主要來自T4噬菌體和大腸桿菌。DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉，也能催化兩個雙鏈DNA片段進行連接。2、DNA連接酶第27頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA連接酶主要有兩種：一種是T4DNA連接酶：T4DNA連接酶由一條多肽鏈組成，相對分子量為6800Da，通常催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率為高。催化反應(yīng)需要Mg2+和ATP，ATP作為反應(yīng)的能量來源。T4DNA連接酶在基因工程操作中被廣泛應(yīng)用。另一種是大腸桿菌DNA連接酶：大腸桿菌DNA連接酶的相對分子量為7500Da，連接反應(yīng)的能量來源是NAD+，此酶催化DNA連接反應(yīng)與T4DNA連接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端連接。第28頁,共76頁，2024年2月25日，星期天體外DNA連接方法目前常用的三種：（1）用T4或E.coliDNA連接酶可連接具有互補粘性末端的DNA片段；（2）用T4DNA連接酶連接具有平末端DNA片段；（3）先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再進行連接。第29頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三、

微生物作為克隆載體的宿主為了保證外源基因在細(xì)胞中的大量擴增和表達(dá)，必須選擇合適的克隆載體宿主。一個理想的克隆載體宿主。第30頁,共76頁，2024年2月25日，星期天宿主基本要求是：

①

能夠高效吸收外源DNA；

②

具有使外源DNA進行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；

③

不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；

④

一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；

⑤

便于進行基因操作和篩選；

⑥具有安全性。第31頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

原核生物的大腸桿菌及真核生物的釀酒酵母，由于他們具有生長迅速、極易培養(yǎng)，能在廉價培養(yǎng)基上生長，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)背景十分清楚等突出優(yōu)點，已成為當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的重要克隆載體宿主。另外還有枯草桿菌和昆蟲細(xì)胞系等。

第32頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)基因工程的基本過程基因工程操作主要步驟為：①分離或合成基因（切），②通過體外重組將基因插入載體（接），③將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞（轉(zhuǎn)），④擴增克隆基因（增），⑤篩選重組體克?。z），⑥對克隆的基因進行鑒定或測序，⑦控制外源基因的表達(dá)，⑧得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物、工程菌（利用基因工程技術(shù)獲得的具有新功能的微生物稱為工程菌）。第33頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、目的基因的分離或合成1，從基因文庫中篩選基因文庫是指生物染色體基因組各DNA片斷的克隆總體（即某一特定生物體全基因組的克隆集合）。人們可以根據(jù)目的基因的性質(zhì)和序列從中篩選。第36頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2，cDNA法目的DNA可用反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板來合成。（以該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再洗脫下編碼該蛋白質(zhì)的特異mRNA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行基因克隆。）cDNA文庫是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫中的每一個克隆只含一種mRNA信息。根據(jù)目的基因的特性可從中篩選。第37頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3，化學(xué)合成法如果目的基因的全序列是已知的，則可以利用化學(xué)合成法直接合成。2kb的基因序列。第38頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、體外重組目的基因用酶切下來，同時打開載體DNA分子，然后將兩者連接成雜合分子。第39頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三、重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。重組DNA人工導(dǎo)入受體細(xì)胞有許多方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、受體細(xì)胞的電穿孔和顯微注射等等。第40頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1，外源DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如果外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；如果外源DNA被構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌體質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進入細(xì)胞。第41頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（2）λ噬菌體的體外包裝和感染如果外源DNA被包裝成λ噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機制導(dǎo)入細(xì)胞。體外包裝是將重組DNA分子與噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，從而組裝成完整的具有感染力的λ噬菌體粒子。第42頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2，外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞重組DNA以轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體。（2）外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞微量注射和電穿孔法為主，還有磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法、聚陽離子轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法等等。

第43頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（3）外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞有微量注射、電穿孔法、共培養(yǎng)法、葉片培養(yǎng)法、基因槍法等等。第44頁,共76頁，2024年2月25日，星期天共培養(yǎng)法：共培養(yǎng)法是指將含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。葉片培養(yǎng)法是指含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物葉片共培養(yǎng)?；驑尫ㄊ抢梦棸驯砻嫖接型庠碊NA的金屬微粒高速射進植物的細(xì)胞、組織或幼苗。第45頁,共76頁，2024年2月25日，星期天四、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴增是指受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后立即進行短時間的培養(yǎng)。如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞壁再生等。第46頁,共76頁，2024年2月25日，星期天五、轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定在制備目的基因時對染色體進行了切割，產(chǎn)生大量的DNA小片斷，故進入受體細(xì)胞的克隆不僅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所獲得的是含有不同克隆子的細(xì)胞群體。在DNA體外重組中，外源DNA片斷與載體DNA的連接反應(yīng)物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，第47頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到100%的理想極限，因此必須使用各種篩選與鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子（接納載體或重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與非轉(zhuǎn)化子，重組子（含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子）與非重組子（僅含有空載載體的轉(zhuǎn)化子），以及期望重組子（含有目的基因的重組子）與非期望重組子（不含有目的基因的重組子）。第48頁,共76頁，2024年2月25日，星期天方法：將轉(zhuǎn)化擴增物稀釋一定的倍數(shù)后，均勻涂布在用于篩選的特殊培養(yǎng)基上，使之長出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克?。?。然后進行新一輪的篩選鑒定。第49頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、載體遺傳標(biāo)記法（重組體表型特征的鑒定）原理是利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子。第50頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑴抗藥性篩選（抗生素平板法）

⑵營養(yǎng)缺陷性篩選

⑶顯性模型篩選

⑷噬菌斑法

⑸探針重組篩選第51頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑴抗生素平板法：如果外源DNA片段插入載體的位點位于抗生素基因之外，將轉(zhuǎn)化的重組體細(xì)胞置于含有該抗生素的培養(yǎng)基平板上，仍可長成菌落。第52頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑵插入失活性：是一種因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象。如，pBR322質(zhì)粒上具有一個四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），已知有24種主要的限制酶在pBR322上都只有一個切點，其中有7種限制酶的切點位于四環(huán)素抗性基因之內(nèi)，3種限制酶的切點位于氨芐青霉素抗性基因（Ampr）之內(nèi)，外源DNA片段插入這些位點之中的任一位點將導(dǎo)致相應(yīng)的抗性基因失活。第53頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑶插入表達(dá)法：在某些載體的標(biāo)記基因前面連接一段負(fù)控制序列，當(dāng)外源DNA片段插入該負(fù)控制序列中，使負(fù)控制序列失活，因而位于下游的標(biāo)記基因因解除阻遏而得到表達(dá)。第55頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑷β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法：許多大腸桿菌的載體質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ/標(biāo)記基因，它包括大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列以及氨基端146個氨基酸殘基的編碼序列，其表達(dá)產(chǎn)物是無活性的不完全酶，稱為α受體；而許多大腸桿菌的受體細(xì)胞在染色體DNA上含有β-半乳糖苷酶羧基端的部分編碼序列，由其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也無活性，但可作為α供體。第56頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

受體和供體一旦結(jié)合，便可恢復(fù)β-半乳糖苷酶的活性，將5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）底物水解成籃色產(chǎn)物。當(dāng)外源DNA片段插入到位于lacZ/標(biāo)記基因內(nèi)部的多克隆位點上時，生長在含有X-gal的平板上的重組子因lacZ/基因的滅活而成白色，非重組子則顯藍(lán)色。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）——誘導(dǎo)物。第57頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定⑴菌落或噬菌斑原位雜交法又稱探針原位雜交法，前提條件是必須擁有與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列。根據(jù)核酸雜交的原理，探針序列特異地雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位檢測。第58頁,共76頁，2024年2月25日，星期天方法步驟：醋酸纖維素濾膜覆蓋在菌落上，用針扎不對稱的三個孔（標(biāo)記），37OC培養(yǎng)1-2h→濾膜NaOH裂解細(xì)菌→中性緩沖液中和NaOH→清洗緩沖液浸泡3min洗去菌體碎片和蛋白→晾干后800C下干燥1~2h固定DNA單鏈→高溫高離子強度下（降低本底）與探針雜交→稍低離子濃度溶液清洗膜三遍（除去未特異雜交的探針），晾干→X-光膠片暗箱內(nèi)曝光。根據(jù)膠片上感光點的位置，在原始平板上挑取相應(yīng)菌落。第59頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑵內(nèi)切酶圖譜鑒定在外源DNA片斷大小以及限制性酶切圖譜已知的情況下，對重組子進行酶切鑒定，不僅能區(qū)分重組分子與非重組分子，有時還能初步確定期望重組子與非期望重組子。第60頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

將初步篩選的陽性克隆即轉(zhuǎn)化子小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒或者重組噬菌體的DNA。用內(nèi)切酶酶切，然后進行電泳。檢測插入DNA片段大小。分子量大于載體質(zhì)粒的為重組子，最終利用載體上的已知酶切位點，建立重組質(zhì)粒插入片段的酶切圖譜，并與已知數(shù)據(jù)進行比較，進而確定期望重組子。第61頁,共76頁，2024年2月25日，星期天①全酶解法：用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切開質(zhì)粒DNA上所有相應(yīng)的酶切位點，形成全酶切圖譜。第62頁,共76頁，2024年2月25日，星期天②部分酶解法：通過限制酶量或限制反應(yīng)的時間使酶切位點發(fā)生切割反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的部分限制性片段，顯然這些片段大于全酶片段，因此能確定同種酶多個切點的準(zhǔn)確位置。第63頁,共76頁，2024年2月25日，星期天③重組子快速搜尋法：（EcoRI-HindⅢ聯(lián)合酶切→BamHI酶切→PstI酶切）。第64頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑶

PCR鑒定用與插入片段兩側(cè)互補序列作為引物，以重組質(zhì)粒DNA作為模板，進行PCR分析，可快速測出插入DNA片段大小及鑒定其序列特異性。第65頁,共76頁，2024年2月25日，星期天⑷DNA序列測定為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組的DNA進行序列測定。（以便最終獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列，精確界定基因的邊界）第66頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

a.DNA的化學(xué)降解測序法b.DNA的雙脫氧末端終止測序法（國際目前常規(guī)測序方法）c.其它：如DNA