3靈芝及靈芝提取物中β-葡聚糖的測(cè)定本文件規(guī)定了靈芝及靈芝提取物相關(guān)產(chǎn)品中β-葡聚糖的分光光度法檢測(cè)方法。本文件適用于靈芝實(shí)體，靈芝孢子粉和靈芝提取物中β-葡聚糖的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1β-葡聚糖β-glucan以β-葡聚糖為主鏈，可溶于水的一系列高分子化合物。4原理靈芝子實(shí)體，靈芝孢子粉和靈芝提取物中β-葡聚糖和α-葡聚糖經(jīng)水提取，使用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（糖化淀粉酶）酶解α-葡聚糖成單糖和寡糖；使用纖維素酶酶解纖維素成單糖和寡糖；使用蛋白質(zhì)酶酶解蛋白質(zhì)成氨基酸；乙醇沉淀β-葡聚糖，單糖、寡糖和氨基酸溶于乙醇被除去；β-葡聚糖經(jīng)水溶解，在硫酸的作用下，先水解成單糖，并迅速脫水形成糖醛化合物，與苯酚形成黃色化合物，在485nm下具有特征吸收，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。5試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。5.1.1硫酸（H2SO4），ρ=1.84g/mL。5.1.2無水乙醇（C2H5OH）。5.1.3苯酚（C6H5OH）。5.1.4鹽酸（HCI）。5.1.5β-葡聚糖對(duì)照品。5.1.6α-淀粉酶（CAS:9000-85-5，20000-60000U/mL）。5.1.7纖維素酶（CAS:9012-54-8，≥45U/mg）。5.1.8蛋白酶（CAS:9014-01-1，≥200U/mg）。5.1.9淀粉葡萄糖苷酶（CAS:9032-08-0，≥10萬U/mL）。5.1.10鹽酸溶液（0.2mol/L）：取18.00mL鹽酸在攪拌狀態(tài)下緩慢加入到800mL水中，混勻，冷卻后用水稀釋至1000mL，即得。45.1.11氫氧化鈉溶液（0.2mol/L取8.00g氫氧化鈉在攪拌狀態(tài)下緩慢加入到800mL水中，混勻，冷卻后用水稀釋至1000mL，即得。5.1.12β-葡聚糖對(duì)照品溶液制備：精密稱取β-葡聚糖對(duì)照品10mg，加水溶解并定容至100ml，混勻，即得0.1mg/mL的β-葡聚糖對(duì)照品溶液。5.1.13苯酚溶液（50g/L）：稱取苯酚5.0g，加水溶解并定容至100ml，混勻，即得。6儀器與設(shè)備6.1紫外分光光度計(jì)。6.2分析天平：感量為0.0001g和0.01g。6.3電熱恒溫水浴鍋。6.4冰箱。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。6.6漩渦混合振蕩器。7分析步驟7.1樣品前處理取樣品約0.5g放入錐形瓶或50mL離心管中，加入10mL水，將樣品渦旋至完全溶解，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至pH6.9，加入0.1mL淀粉酶，并在20℃恒溫水浴振蕩2小時(shí)酶解。用0.2mol/L鹽酸溶液將溶液的pH值調(diào)至5.0加入10mg纖維素酶，并在37℃恒溫水浴酶解2小時(shí)。用0.2mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.5，向溶液中加入約50mg的蛋白酶，并在37℃恒溫水浴振蕩2小時(shí)酶解。用0.2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.8，將約0.1mL的淀粉葡萄糖苷酶添加到溶液，并在60℃恒溫水浴中振搖2小時(shí)酶解。酶解液轉(zhuǎn)移并用水洗滌干凈至50mL容量瓶，用水定容至刻度。將溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管，將溶液離心（3000rpm，10min），取上清液5mL于50mL離心管，加入20mL無水乙醇，搖勻（多管式渦旋振蕩器，轉(zhuǎn)速：約2000rpm，10min），放置4℃沉淀過夜（8h以上）。將溶液離心（3000rpm，20min），棄上清液。向沉淀中加入25mL80%乙醇樣品，并在4℃下沉淀1小時(shí)。將溶液離心（3000rpm，20min）。離心后棄去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。7.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制精密量取β-葡聚糖對(duì)照品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分別置于25mL具塞比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至1.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，混勻；繼續(xù)加入濃硫酸5.0mL后小心混勻，置沸水浴中煮沸15min取出，置冰浴中冷卻5min，用分光光度計(jì)在485nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿中測(cè)定吸光度值，以β-葡聚糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.3試樣的測(cè)定準(zhǔn)確量取供試品溶液1mL，置25mL具塞比色管中，照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制項(xiàng)下的方法，自“加入50g/L苯酚溶液1.0mL”起，同法操作，測(cè)定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中β-葡聚糖的質(zhì)量，計(jì)算即得。8結(jié)果計(jì)算X=5式中：X——β-葡聚糖的含量，單位為毫克每克（mg/g）；C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的β-葡聚糖的質(zhì)量，單位為微克(μg）；M——樣品的取樣量，單位為克（g）；V1——酶解液轉(zhuǎn)移并用水洗滌干凈后定容體積，單位為毫升（mLV2——取上清液于