游離酶制藥游離酶制藥是指游離酶在制藥行業(yè)中的應(yīng)用。例如，利用酶的專一性進(jìn)行底物的拆分，也可利用酶的專一性和高效性，水解含有某一類基團(tuán)的大分子，生成小分子化合物。例如：利用核糖核酸酶水解DNA，可獲得核苷酸。酶基礎(chǔ)知識酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有催化功能的生物分子，所以又稱為生物催化劑(biocatalysts）絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)。

酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)（Enzymaticreaction）。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物（substrate）。酶是生物催化劑酶的分類與命名一酶的分類（一）根據(jù)酶的化學(xué)組成可將酶分為：1單純蛋白酶類：只含有蛋白質(zhì)成分2結(jié)合蛋白酶類（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（輔助因子）

全酶=酶蛋白+輔助因子輔助因子與酶蛋白結(jié)合比較疏松的小分子有機(jī)物與酶蛋白結(jié)合緊密的小分子有機(jī)物。金屬離子可作為輔助因子。金屬離子輔酶輔基酶蛋白和輔助因子單獨(dú)存在均無催化活性，只有二者結(jié)合為全酶才有催化活性。酶蛋白決定酶催化專一性，輔助因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體決定反應(yīng)的專一性。

某些小分子有機(jī)化合物與酶蛋白結(jié)合在一起并協(xié)同實(shí)施催化作用，這類分子被稱為輔酶（或輔基）。輔酶是一類具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的化合物。參與的酶促反應(yīng)主要為氧化-還原反應(yīng)或基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。大多數(shù)輔酶的前體主要是水溶性B族維生素。許多維生素的生理功能與輔酶的作用密切相關(guān)。（二）根據(jù)酶蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將酶分為單體酶：以一個(gè)獨(dú)立的三級結(jié)構(gòu)為完整生物功能分子的最高結(jié)構(gòu)形式的酶。寡聚酶：以一個(gè)獨(dú)立的四級結(jié)構(gòu)為完整生物功能分子的最高結(jié)構(gòu)形式的酶。

多酶復(fù)合體：由多種酶彼此鑲嵌成一個(gè)功能完整的具有特定結(jié)構(gòu)的復(fù)合體,它們相互配合依次進(jìn)行，催化連續(xù)的一系列相關(guān)反應(yīng)。（三）、酶的分類

根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型，按照國際系統(tǒng)分類方法，將酶分為六大類：1.氧化-還原酶2.轉(zhuǎn)移酶3.水解酶4.裂解酶5.異構(gòu)酶6.合成酶（一）習(xí)慣命名方法

（1）根據(jù)作用底物來命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根據(jù)所催化的反應(yīng)的類型命名，如脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等。（3）兩個(gè)原則結(jié)合起來命名，如丙酮酸脫羧酶等。（4）根據(jù)酶的來源或其它特點(diǎn)來命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。二酶的命名（二）國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。例如：習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶

系統(tǒng)名稱:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶

酶催化的反應(yīng):谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸酶的編碼乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號每個(gè)酶都有一個(gè)有四個(gè)數(shù)字組成的編碼第二節(jié)酶催化作用的特性酶是生物催化劑，與無機(jī)催化劑相比，二者有共性；但酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，又在生物體內(nèi)作用，因此酶的作用又有特性。

一酶和一般催化劑的共性1.用量少而催化效率高；2.它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。3.只能催化熱力學(xué)允許的反應(yīng)，在反應(yīng)前后不發(fā)生改變。二酶催化作用特性1．高效性2．專一性3．反應(yīng)條件溫和4.酶的催化活性可調(diào)節(jié)控制鎖鑰學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對酶促反應(yīng)的動力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km

—米氏常數(shù)Vmax

—最大反應(yīng)速度（二）米氏方程V=Vmax

[S]Km

+[S]米氏方程Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。（三）米氏常數(shù)的意義及測定米氏常數(shù)Km的意義(1)不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。(2)Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。(3)由若干酶催化一個(gè)連續(xù)代謝過程時(shí)，如果確定各種酶催化反應(yīng)底物的Km值及相應(yīng)的底物濃度時(shí)，可推斷出其中Km值最大的一步反應(yīng)為該連續(xù)反應(yīng)中的限速反應(yīng)，該酶為限速酶（關(guān)鍵酶）。

AB

C

D若>>，則哪酶為限速酶？E1E2E3

米氏常數(shù)的測定

基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。例：雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的雙倒數(shù)形式：1Km11—=——.—+——

vVmax[S]Vmax

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測定：-4-202468100.20.40.60.81.01/[S](1/mmol.L-1)1/v酶的Km在實(shí)際應(yīng)用中的意義（1）鑒定酶：通過測定Km，可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。（2）判斷酶的最適底物(天然底物)。（3）計(jì)算一定速度下底物濃度。1、根據(jù)米氏方程，有關(guān)[s]與Km之間關(guān)系的說法不正確的是（）。A.當(dāng)[s]<<Km時(shí)，V與[s]成正比；B.當(dāng)[s]＝Km時(shí)，V＝1/2VmaxC.當(dāng)[s]>>Km時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)。D.[s]=2/3Km時(shí)，V=25％Vmax2、已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的80％時(shí)底物的濃度應(yīng)為（A）。A.0.2mol.L-1B.0.4mol.L-1C.0.1mol.L-1D.0.05mol.L-1二pH的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。pHv最適pH（optimumpH）pH穩(wěn)定性：在一定pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定pH對酶作用的影響機(jī)制：1.環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活；2.影響酶活性基團(tuán)的解離；3.影響底物的解離。三溫度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。高溫兩種不同影響：1.溫度升高，反應(yīng)速度加快；2.溫度升高，酶熱變性速度加快。Tv最適溫度低溫影響：1.溫度降低，酶活性降低2.溫度過低,酶無活性但不變性四激活劑對酶作用的影響

凡能提高酶活力的物質(zhì)都是酶的激活劑。如Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。金屬離子：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+陰離子：

Cl-、Br-有機(jī)分子還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA

這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用。一般情況下，一種激活劑對某種酶是激活劑，而對另一種酶則起抑制作用；對于同一種酶，不同激活劑濃度會產(chǎn)生不同的作用。應(yīng)用激活劑時(shí)應(yīng)注意五抑制劑對酶活性的影響使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：1.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。2.能夠與酶以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。一酶活力的測定(1)測一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量(2)測定完成一定量反應(yīng)所需時(shí)間測定時(shí)確定三種量：①加入一定量的酶；②一定時(shí)間間隔；③物質(zhì)的增減量。二酶活力單位：是衡量酶活力大小的計(jì)量單位,規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位或又稱酶單位。(一）國際單位：1、國際單位U（Unit）：在最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。1U=1μmol/min2、“Katal”單位：指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。

1Kat=1mol/s

Kat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，

1U=1/（6×107）Kat

以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶單位表示1分鐘使1μmol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個(gè)相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2μmol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。

在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計(jì)算。比活力（比活性）：每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（酶單位/mg蛋白）。實(shí)際應(yīng)用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示（如：酶單位/mL（液體制劑），酶單位/g（固體制劑））。

對同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少），所以比活力是評價(jià)酶純度高低的一個(gè)指標(biāo)。

在評價(jià)純化酶的純化操作中，還有一個(gè)概念就是回收率。

回收率=某純化操作后的總活力/某純化操作前的總活力［總活力=總體積×酶活力或總質(zhì)量×比活力］

三比活力稱取25mg蛋白酶配成25mL溶液，取2mL溶液測得含蛋白氮0.2mg，另取0.1mL溶液測酶活力，結(jié)果每小時(shí)可以水解酪蛋白產(chǎn)生1500μg酪氨酸，假定1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量，請計(jì)算：（1）酶溶液的蛋白濃度及比活。（2）每克純酶制劑的總蛋白含量及總活力。解：（1）蛋白濃度=0.2×6.25mg/2mL=0.625mg/mL；（2）比活力=（1500/60×1ml/0.1mL）÷0.625mg/mL=400U/mg；（3）總蛋白=0.625mg/mL×1000mL=625mg；（4）總活力=625mg×400U/mg=2.5×10U。下表是從小牛腸中提純堿性磷酸酶的例子。試計(jì)算其總活力、比活力、回收率和純化倍數(shù)，并填入表中空格。純化步驟酶液總體積/mL酶活力/U·mL-1總活力/U×103蛋白含量/mg·mL-1比活力/U·mg-1回收率/%純化倍數(shù)初提取液1200020524602.12971001PH5.0沉淀50002160.82丁醇抽提44501660.0360%丙酮沉淀55123602.0536%丙酮沉淀20262501.9650%丙酮沉淀20189000.94活性炭吸附3273400.11下表是從小牛腸中提純堿性磷酸酶的例子。試計(jì)算其總活力、比活力、回收率和純化倍數(shù)，并填入表中空格。純化步驟酶液總體積/mL酶活力/U·mL-1總活力/U×103蛋白含量/mg·mL-1比活力/U·mg-1回收率/%純化倍數(shù)初提取液1200020524602.12971001PH5.0沉淀500021610800.8226343.93丁醇抽提4450166738.70.035533305760%丙酮沉淀5512360679.82.05602927.66236%丙酮沉淀20262505251.961339321.313850%丙酮沉淀20189003780.942010615.4207活性炭吸附3273402350.11667279.5688［總活力=總體積×酶活力或總質(zhì)量×比活力］固定化酶制藥

學(xué)習(xí)目標(biāo)能力目標(biāo)：能判斷與區(qū)分各種固定化酶的方法；知識目標(biāo)：了解固定化酶的研究歷史；掌握固定化酶的定義，理解固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)；理解固定化酶制備的一般原則與注意事項(xiàng)一、游離酶的缺點(diǎn)1.酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH、和無機(jī)離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后酶難以回收。3.反應(yīng)結(jié)束后，酶成為產(chǎn)物的雜質(zhì)。

二、概念固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強(qiáng)穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開等顯著特點(diǎn)。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體或固定化細(xì)胞。

三、酶固定化的歷史？1953年Grubhofer,Schleith以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶1969年千畑一郎固定化氨基?；?，DL-氨基酸拆分1971年第一屆國際酶工程大會固定化酶：ImmobilizedEnzyme1973年日本固定大腸桿菌生產(chǎn)天冬氨酸1979年日本固定化植物細(xì)胞：長春花和毛地黃細(xì)胞1982年日本固定原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸

一、酶的固定化方法交聯(lián)法凝膠包埋法半透膜包埋法（半透膜）離子鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法熱處理法結(jié)合法包埋法吸附法1.吸附法吸附法是利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法。活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、條件溫和、載體廉價(jià)易得、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：結(jié)合力不牢、容易脫落。選擇載體的原則：（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。2.包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺……（1）凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體包埋在凝膠的微孔內(nèi)的固定化方法。海藻酸：來自海藻的由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的多糖?？梢种拼笫竽c道對鍶(90Sr)吸收。除褐藻等海藻外，棕色固氮菌等細(xì)菌亦產(chǎn)生藻酸類型的多糖。海藻酸為淡黃色粉末；無臭；幾乎無味，在水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中不溶，在氫氧化堿溶液中溶解。有助懸、增稠、乳化、粘合等作用?？捎脼槲⒛夷也?，或作為包衣及成膜的材料。卡拉膠：鹿角菜膠、角叉菜膠。是從某些紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，化學(xué)結(jié)構(gòu)是由半乳糖及脫水半乳糖所組成的多糖類硫酸酯的鈣、鉀、鈉、銨鹽。由于硫酸酯結(jié)合形態(tài)的不同，可分K型、I型、L型。在果凍，軟糖，冰激凌等食品工業(yè)應(yīng)用廣泛。（2）半透膜包埋法（微囊）將一定量的酶或微生物包埋在具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。

優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合力牢、活力回收高、底物專一性不變。缺點(diǎn)：制備較難，載體無法回收、擴(kuò)散限制。包埋法酶溶液被包裹在膜內(nèi)，膜既能使酶存在于類似于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，又阻止了酶的脫落或直接與外環(huán)境接觸。3.結(jié)合法選擇適宜載體，使之通過共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。（1）離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE纖維素、TEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠

……++++++++++++----------------++++++++（2）共價(jià)結(jié)合法：通過共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：纖維素瓊脂糖凝膠葡聚糖凝膠甲殼質(zhì)氨基酸共聚物……酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基載體活潑基團(tuán)

共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的步驟：3載體活化的方法4.交聯(lián)法（不需載體）