第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)P193復(fù)習(xí)抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結(jié)合

抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結(jié)合抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結(jié)合抗原或抗體檢測原理：借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行定性或定量的檢測。Equivalence–Latticeformation抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結(jié)合抗原或抗體檢測原理一種細(xì)菌可以刺激多少種抗體產(chǎn)生？抗原抗體（Antibody)抗體（Antibody，Ab)免疫球蛋白的雙重性免疫球蛋白是一種蛋白質(zhì)，是抗體(Ab1)；同時又可引起機(jī)體產(chǎn)生抗體（抗抗體,Ab2），所以既是抗體又是抗原。

AgAb1Ab2

免疫學(xué)檢測技術(shù)主要應(yīng)用：對多種免疫性疾病的診斷、療效評估、發(fā)病機(jī)制探討;對抗原性物質(zhì)、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、粘附分子或細(xì)胞受體等的定性、定量檢測。第一節(jié)體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

的特點(diǎn)及影響因素

抗原-抗體反應(yīng)包括：沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、中和反應(yīng)等。

抗原-抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。免疫標(biāo)記技術(shù)包括：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)等。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：P1931.高度特異性：抗原-抗體的特異性結(jié)合。2.

可逆結(jié)合：抗原抗體分子表面的非共價鍵結(jié)合。4.反應(yīng)的兩個階段：

特異性結(jié)合階段；可見的反應(yīng)階段。3.

濃度和比例：是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，與抗原和抗體兩者的分子濃度和比例密切相關(guān)?？乖贵w比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響（二）抗原-抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉（適當(dāng)濃度的電解質(zhì)）作為稀釋液。2.溫度：反應(yīng)常在37℃水浴或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度

為pH6-8?？乖?抗體反應(yīng)受多種因素影響第二節(jié)檢測抗原或抗體的體外試驗(yàn)?zāi)磻?yīng)沉淀反應(yīng)（中和反應(yīng)）免疫標(biāo)記技術(shù)：用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)一、凝集反應(yīng)

(Agglutination)

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合、凝集的現(xiàn)象。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法（定性試驗(yàn)）和試管法（半定量試驗(yàn)）。常見血清學(xué)檢測1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測血清1:41:81:16細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)。一、凝集反應(yīng)

(Agglutination)2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，形成致敏顆粒，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)的顆粒凝集現(xiàn)象。間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYY+Y體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗(yàn)正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內(nèi)的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗(yàn)血球凝集二、沉淀反應(yīng)

（Precipitation)

血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAbingel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應(yīng)—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。1.單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板；打孔，將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖c抗體相遇，形成沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)2.雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。3.免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)將待測血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，不同分子量蛋白組分開，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，與不同區(qū)帶的蛋白抗原作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白種類分析。4.火箭電泳（RocketElectrophoresis)也稱免疫擴(kuò)散，是把單向免疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。特點(diǎn)：需時較短，用于快速沉淀標(biāo)本中抗原含量的測定?；鸺娪臼疽鈭D3.免疫標(biāo)記技術(shù)P194檢測原理通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體(單克隆或多克隆)或抗原檢測組織、細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原或抗體物質(zhì)，形成抗原-抗體復(fù)合物；利用此復(fù)合物上帶有預(yù)先標(biāo)記的標(biāo)記物，通過與標(biāo)記物相對應(yīng)的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，以達(dá)到診斷、鑒別診斷和研究的目的?？勺鳛榭乖奈镔|(zhì)有酶、受體、抗體、細(xì)胞外基質(zhì)激素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體。免疫標(biāo)記物顯色原理（1）免疫酶測定法（2）免疫熒光技術(shù)（3）放射免疫測定法（4）發(fā)光免疫分析（5）免疫膠體金技術(shù)（6）免疫印跡技術(shù)（1）免疫酶測定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。a）b）免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測（2）免疫熒光技術(shù)P195將熒光素（異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC、藻紅蛋白，PE)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，對標(biāo)本中抗原的鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。直接熒光法：將熒光素直接標(biāo)記抗體作標(biāo)本染色。優(yōu)點(diǎn)：是特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。優(yōu)點(diǎn)：敏感性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢測。補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法：在間接法的第一步抗原-抗體反應(yīng)時加入補(bǔ)體，使之與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。間接免疫熒光法示意圖免疫熒光顯微技術(shù)海馬細(xì)胞微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)

培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞微管呈綠色核呈藍(lán)色流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對單個細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞儀工作原理（3）放射免疫測定用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I。放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測技術(shù)。放射性核素顯示的高靈敏性，使檢測的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質(zhì)的測定。（4）化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)P196將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實(shí)現(xiàn)自動化分析?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定生物發(fā)光免疫測定化學(xué)發(fā)光酶免疫測定電化學(xué)發(fā)光免疫測定⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。⑥免疫印跡法-Westernblotting免疫印跡法（Immunoblotting）將凝膠電泳與固相免疫測定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測多種病毒（如HIV）的抗體或抗原。免疫印跡法示意圖生物芯片基因芯片蛋白質(zhì)芯片微流控芯片蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的抗體或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度將指示蛋白質(zhì)對應(yīng)抗體及其相互結(jié)合的程度。微生物檢測、腫瘤篩查。

4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究蛋白質(zhì)芯片的意義蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物,接近生命活動的物質(zhì)層面；探針蛋白特異性高、親和力強(qiáng),可簡化樣品前處理，甚至可直接利用生物材料(血樣、尿樣、細(xì)胞及組織等)進(jìn)行檢測；適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物；有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。蛋白質(zhì)檢測芯片

蛋白質(zhì)功能芯片

蛋白質(zhì)芯片的分類PoetzOet.al,MechanismsofgeingandDevelopment,2005,126,161–170.第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測

（自學(xué)+實(shí)驗(yàn)）（P197-202）檢測各種淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上T細(xì)胞功能測定體外法：T細(xì)胞增殖試驗(yàn)形態(tài)學(xué)檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內(nèi)法：用生物抗原或化學(xué)抗原作皮內(nèi)試驗(yàn)。OT-PPD皮試

一、T細(xì)胞功能的檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)T細(xì)胞分泌功能測定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)1.原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細(xì)胞

ConA-------T細(xì)胞

PWM-------T、B細(xì)胞

LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

3.檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細(xì)胞（4-6天）母細(xì)胞化同位素法：PHA淋巴細(xì)胞（54h）

DNA合成期+3HTdR摻入

收集細(xì)胞

檢測β射線

測定細(xì)胞內(nèi)的3H－TdR（1）形態(tài)學(xué)檢查法方法學(xué)評價：優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性MTT測吸光度(3)MTT比色法(二)T細(xì)胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。

（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)1.原理：靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

圖15-2T細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)示意圖靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時51Cr釋放法(四)體內(nèi)試驗(yàn)特異性抗原皮膚試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)二、B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)溶血空斑試驗(yàn)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗(yàn)(一)B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)抗IgM細(xì)菌脂多糖SAC的SPA

B細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法(二)溶血空斑試驗(yàn)1.原理：2.方法學(xué)：經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn)被動溶血空斑試驗(yàn)

3．臨床應(yīng)用與評價溶血空斑試驗(yàn)主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。

(三)

B細(xì)胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法1.原理：2．應(yīng)用與方法學(xué)評價：該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。(四)體內(nèi)試驗(yàn)體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。染色計(jì)數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細(xì)胞熒光測發(fā)光強(qiáng)度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法三、NK細(xì)胞活性測定靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:

K562細(xì)胞株培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）示意圖靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細(xì)胞毒試驗(yàn)（51Cr釋放法）示意圖：（Na51CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞）細(xì)胞毒試驗(yàn)（乳酸脫氫酶釋放法）

正常情況下，乳酸脫氫酶（LDH）存在于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)