基因工程的相關熱點

隨著生物技術的飛速發(fā)展，曾經(jīng)遙不可及的PCR技術逐步走進了高中實驗室。PCR技術應

用廣泛，如實時熒光定量RT-PCR技術、重疊延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等,

高考試題中有關PCR的問題越來越多，設問考查深度也明顯提升。各種PCR技術不是孤立的，

它們均已常規(guī)PCR為基礎，為實現(xiàn)特定目的而進行了一定改進，但也有各自的局限性，因此在

必要時可同時使用幾種擴增技術，如多重巢式PCR、反向實時熒光定量PCR等。

在高考備考中，要關注不同擴增技術的本質差異，同時總結此類試題的解題步驟；一是尋

找題圖有效信息，確定所考PCR類型；二是迅速再憶所考PCR的獨特性，猜測出題人可能得

意圖；二是根據(jù)設問對前述猜測進行驗證，并領悟出題人挖掘的新考點，進而對知識框架進行

士親

7TS口0

命題點：PCR技術與病毒檢測、基因定點突變與基因改造、基因編輯技術、同尾酶等。

一、PCR技術及其應用

1、PCR技術與病毒檢測一一實時熒光定量PCR（RT-PCR）

新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。先從樣本中提取RNA,RNA

中可能有新冠病毒的RNA,同時也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生物的RNAO

通過逆轉錄酶將樣本的RNA逆轉錄為cDNA,并進行PCR擴增，在PCR反應體系中，包含一對

特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核昔酸序列，兩端分別標記了報告

熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；若反應體

系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降

解，報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光

定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達預先設定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關，病毒核

酸濃度越高，Ct值越?。ㄈ鐖D）。

平臺期｛廠

65

線性增長期，/

Ct值［/熒光閾值

指數(shù)增長期［VI

010203040

循環(huán)數(shù)

乙

接

（1）RT（reversetranscription）-PCR即反轉錄聚合酶鏈反應，是將RNA的反轉錄和cDNA的

聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。

RNA^I

R

N

A

翟逆轉錄酶

錄

RNA^

DN嬋鏈

cDN嬋鏈

D

N

A

擴DN鎮(zhèn)合酶

增

DN憚鏈

DNA?鏈

（2）優(yōu)點：早期診斷、靈敏度和特異性高，判斷是否感染新冠病毒的直接接證據(jù)。

2、重疊延伸PCR技術

重疊延伸PCR技術是一項重要的基因定點突變技術,其主要設計思路是用具有互補配對片

段的引物（圖中的引物2和3,突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點），分別進行PCR,獲

得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。

水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基

因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）替換為賴氨

酸（密碼子為AAA、AAG）,從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見圖。

擬突變位點

5---------A-------3'

3'---------------T--------5'

引物引物

第2/4

…」/3：—5'

一3資53,

I5Z3A—3'

階3一T-------------5'3'匕5，

Z而53,

段1

15弓

I使用引物1和2引物3|使用引物3和4

\進行

、PCR\進行PCR

Z5'一個--------3'

53A

第3'1-------------5'

二混合、變性后，雜交

階,

5'人

段3'^——5'

首先使用DNA聚合酶延伸，

然后使用引物1和4進行PCR

5'人3'

3'人5'

突變后的基因

困段回接

(1)PCR擴增過程

高溫變性：溫度超過90℃,雙鏈DNA解聚為單鏈

低溫復性：溫度下降到50°C左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合

中溫延伸：溫度上升到72°C左右，溶液中的4種脫氧核甘酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下,

根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈

3、大引物PCR技術

大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR,這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游

引物和常規(guī)下游引物。該技術的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物

進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條

DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。

常規(guī)下游引物

擬突變位點3'?---------5'

5,-------X--------------------------3'

y-------X--------------------------5'

突變上游引物

進行PCR

5，_/\y

產物作為下一輪PCR的大引物V5'

下游大引物

3,5,

S'3,

3,5'

S'A3'

進行PCR

常規(guī)上游引物

/\

5,3,

/\

3'5'

國用國國

(1)引物設計需要遵循以下原則：

①引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應大于38,過長會導致其延伸溫度

大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進行反應。

②引物序列在模板內應當沒有相似性較高的序列，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易

導致錯配。

③引物3,端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。末位堿基為A的錯配效率明

顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3'端使用堿基A。

④引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應。

⑤引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。

⑥AG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性。應

當選用3'端AG值較低(絕對值不超過9),而5'端和中間AG值相對較高的弓|物。

⑦引物二聚體及發(fā)夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降

低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

⑧對引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點。

4、反向PCR測定未知DNA區(qū)域

當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩

已知序列

端的未知序列時，可采用反向PCR技術。原理：用限

位點一切位點

制性內切核酸酶切割該DNA,隨后使用DNA連接酶將限制性內切酹酹解

R

獲得的酶切產物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側攜

帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板

設計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列

變性并加入根據(jù)已

反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列合成的引物

知序列。

PCR擴堵

LR

已知序列已?知序列

反向PCR的原理示意圖

（1）PCR技術由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增

形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物

與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板一引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶

序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復

制鏈

二、同尾酶

同尾酶中，識別序列不同的限制酶，雖然識別的堿基序列不同，但是切開的黏性末

端的堿基卻能夠正好相互配對，在DNA連接酶的作用下能形成重組DNA分子，如：限制

酶BamHI識別的堿基序列為一GIGATCC—,限制酶BglII識別的堿基序列為一AIGATCT

—,限制酶Mb。：［識別的堿基序列為一IGATC一,限制酶BamHI切開的DNA兩條鏈的黏

性末端中沒有被配對的堿基是GATC-,限制酶BglII和限制酶MboI切開的黏性末端未

配對的堿基也都是GATC—,因此也可以通過堿基互補配對的形式重組。

國隕國回

(1)定義：來源不同，識別的堿基序列也不相同，但能切割產生相同末端的限制酶叫同

尾酶。

(2)同尾酶識別的靶序列不相同，但能切割產生相同的黏性末端，因此也可以通過堿基

互補配對的形式重組。

三、啟動子的類型

1、組成型啟動子：在生物體的所有組織中都有活性的啟動子。其調控不受外界條件的影響，

所啟動基因的表達具有持續(xù)性，但不表現(xiàn)時空特異性。例如，在雙子葉植物中最常用的組成型

啟動子是花椰菜花病毒啟動子、T7噬菌體啟動子。

2、誘導型啟動子：能被誘導表達的啟動子。表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在

的條件下才能表達目的產物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又

可減少菌體蛋白酶對產物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。常見的誘導型啟動子有Lac

乳糖操縱子以及在此基礎上衍生出的多種誘導型啟動子。

3、組織熱異性啟動子：只有在特定的器官或組織中才能啟動基因的表達，如神經(jīng)細胞等組織

特異性啟動子。

國E3圖陶

(D啟動子的作用：

①RNA聚合酶識別結合的位點，從而影響基因的表達

②通過改變啟動子的序列，可以控制基因的表達模式，從而改變基因的功能

③啟動子可用來改變基因組中某一特定基因的表達量

④啟動子可以用來控制基因組中某一特定基因的表達量

熱點集訓

1、臨床上常采用RT-PCR技術，對受測者咽拭子取樣后進行新型冠狀病毒核酸檢測。RT-PCR

是指以病毒的RNA為模板合成cDNA,并對cDNA進行PCR擴增的過程。為定量測定樣品中病毒

的核酸，常采用實時熒光PCR擴增技術，該技術原理如下圖所示。在PCR反應體系中每加入一

對引物的同時，加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針，當TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探

針處，會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光信號生成。

CT值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說法錯誤的是（）

警

木恃1—病毒

RNAcDNA

A.引物、熒光探針均具有特異性，通過氫鍵與cDNA中的目的基因特異性結合

B.熒光探針的水解發(fā)生在PCR過程中的延伸階段

C.樣本中初始病毒核酸量越多，CT值就越大

D.TaqDNA聚合酶催化DNA的合成方向是從子鏈的5，端向3,端延伸

2、人類Y基因啟動子上游的調控序列中含有BCLUA蛋白結合位點，該位點結合BCLUA蛋

白后，Y基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對Y基因表達的抑制，可對某

種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了Y基因上游不同長度的片段，將這些片段分別

插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如

圖所示。

注：

，基因F1~F7,R引物

P：雌激素誘導下發(fā)揮

;—?—-------f--------?作用的啟動子

塊il-N

；FlF2Xh01F7Muni,Sall終止于

載體的終子熒光蛋白基因

部分結構二滅堂口上口P基因

/Xhol:CTCGAG

1II—EcoRI:(AATTC

GelEc'oRIMiniEcoRlXhol如：子

Sall:CTCGAC

Nhel：CTZTAGC

（1）為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別

序列。據(jù)圖可知，在儲?F?末端添加的序列所對應的限制酶是—，在R末端添加的序列所

對應的限制酶是0本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要一種酶。

（2）將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉化后，含笆?Fe與R擴增產物

的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R

擴增產物的受體細胞無熒光的原因是—O

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含迪?F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含

Fs?Fe與R擴增產物的受體細胞仍有熒光。若Y基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置

不含有BCLUA蛋白的結合位點序列，據(jù)此結果可推測，BCLUA蛋白結合位點位于,理

由是

3、反向PCR流程如圖所示，該技術可利用一段已知DNA序列設計合理的引物，擴增已知序列

兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序為“5'-AACTATGCGCTCATGA-……

-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列敘述錯誤的是（）

A.I酶切：用一種限制酶切割DNA,以使兩端未知序列形成相同的黏性末端

B.II連接：使用DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間形成磷酸二酯鍵

C.設計的兩種引物分別是“5'-AACTATGCGCTCATGA-3'”和"5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'”

D.對PCR產物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可能為

“5'-AATTCCAGT-..-CTGAATT-3'”

4、某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一

端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得

Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引

物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。

編碼區(qū)非編碼區(qū)

插入前

大片段

啟動子區(qū)?編碼區(qū)！非編碼區(qū)

插入后^小片段

J弓扁

下列敘述正確的是（）

A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達

B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白

C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子

D.若用引物1和引物3進行PCR,能更好地區(qū)分雜合子和純合子

5、不對稱PCR技術是利用不等量的一對引物來產

生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法，如圖所示。不1,1——限制性引物

非限制性引物

對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物,

兩者的比例通常為1/50/1/100.PCR反應的最初若干次循環(huán)中，其擴增產物主要是雙鏈DNA

（dsDNA）,在限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA.下列相關說法正確的是（）

A.兩種引物與模板鏈結合時，需將溫度控制在72℃左右

B.PCR擴增時，在DNA解旋酶的作用下雙鏈DNA解聚為單鏈

C.通過不對稱PCR技術最后大量獲得的ssDNA的堿基序列與圖中甲鏈的相同

D.PCR擴增時，子鏈分別沿限制性引物的5,端、非限制性引物的3,端延伸

6、重疊延伸PCR技術是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，從而在隨后的擴

增反應中通過重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭

素基因的特定位點引入特定突變，以實現(xiàn)基因的定點突變，原理見圖。下列說法正確的是（）

A.過程②的擴增緩沖溶液中一般要添加蠅2+

B.若引物1、引物2組成的反應系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應系統(tǒng)中均進行一次DNA分子

的復制后，一共會產生4種DNA分子

C.經(jīng)過過程④獲得的雜交DNA有2種,都可以經(jīng)過過程⑤獲得目的基因

D.過程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，需要引物

7、通過引物設計運用PCR技術可以實現(xiàn)目的基因的定點突變如圖為/W物

基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T第一輪PCR].

不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反二：，

PCR產物用作大引物

應體系中引物1和引物2的5'端分別設計增加限制性內切酶a和限-J——

制性內切酶b的識別位點。有關敘述不正確的是（）氈二二I

A.兩種引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因的定向插入

B.一個DNA分子在第2輪PCR后，得到的四個DNA分子各不相同

C.第2輪PCR,引物1與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.在第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/4

8、新冠病毒包膜表面的S蛋白能識別人體細胞膜表面的ACE2受體并導致病毒入侵人體細胞。

制備重組亞單位新冠疫苗的線路是：提取新冠病毒RNA一通過RT-PCR（反轉錄酶聚合酶鏈式反

應）技術擴增篩選RBD蛋白（S蛋白中真正與ACE2結合的關鍵部分）基因（圖1）一構建基因

表達載體（圖2）一導入CH0細胞并培養(yǎng)一提取并純化RBD蛋白一制成疫苗。圖3為利用電泳

技術對PCR的產物進行純度鑒定，1號泳道為標準（Marker）,2號泳道為陽性對照組，3號

泳道為實驗組。下列相關敘述錯誤的是（）

EcoRISmaIEcoRI

引物1J引物2引物也引物4

t=J▼a2，

tIIHIIIIIIIIHL

引尉菊16弓粉T麗菽123

BaftiHb----Y一'Hindm

RBD蛋白基因

圖1RBD蛋白基因結構與引物位置示意圖

圖3電泳鑒定

A.利用RT-PCR技術獲取RBD蛋白基因時，需加入逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶

B.利用PCR擴增含有限制酶切點的RBD蛋白基因時，應選擇的引物為引物4、引物5

C.2號泳道是以（提純的）RBD蛋白基因片段為材料所做的陽性對照組

D.為提高目的基因和運載體的正確連接效率，應選擇限制酶EcoRI切割

9、（不定項）稻米胚乳直鏈淀粉含量高會導致食用品質差。研究發(fā)現(xiàn)，水稻蠟質基因（Wx）

編碼直鏈淀粉合成酶。若Wx基因中第226位堿基是正常的G,該位點所在的內含子能被正常

剪接，胚乳中直鏈淀粉含最高，基因型記做GG；若該位點突變成T,則不能被正常剪接，胚乳

中直鏈淀粉的合成水平會降低，基因型記做TT。為檢測Wx基因該位點堿基是G或T,研究人

員以待測水稻葉片總DNA為材料，以Wx基因片段設計引物，對PCR擴增產物經(jīng)AccI酶切后電

泳。如圖所示，已知引物1為5,-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3,,AccI酶的識別位點為5，

-GTATAC-3',兩引物之間無另外的AccI酶的識別位點。下列敘述不正確的是（）

GCTTCACTTCTCTGCTTGTGTTCAACTCTCGTTAAATCAT

高直錐淀粉含量（GG）和中等直捱淀粉含量（TT）水稻品種中蠟質基因部分DNA順序

A.該實驗中需設計的引物2為5,TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3'

B.若電泳結果只能觀察到530bp的DNA條帶，則表明該水稻品種為TT型

C.GT雜合型水稻品種酶切電泳結果為3條條帶

D.組成上述兩種淀粉合成酶的氨基酸的種類不同，數(shù)目相同

10、In-Fusion技術是一項新型的無縫克隆技術。該技術關鍵是要在目的基因兩端構建與線性

化質粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常為15-20bp),然后用In-Fusion酶處理即可

實現(xiàn)無縫連接。它的操作步驟大致為：①利用PCR技術將質粒線性化；②PCR擴增出兩端含線

性化質粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質粒同源區(qū)域在In-Fusion酶作用下形成

重組質粒；④將重組質粒導入受體細胞?；卮鹣铝袉栴}。

引磔;引物2

引物A目,的基因

5'——3'/

3'—5'

①丁引物B

V②PCR

[iiiTTrniil

同源序列1同源序列2

In-Fusion酶

同源序列

互換重組

受體細胞

⑴過程①需要用到的酶是。過程③中，同源序列1與同源序列2中的堿基序列不同，

這樣設計的好處是。

⑵為保證擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)序列

進行設計。

⑶若目的基因是氨葦青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細胞。為檢測已轉化大腸桿菌的

抗性效果，在含有氨葦青霉素和不含氨葦青霉素的培養(yǎng)基上分別接種等量的已轉化大腸桿菌并

培養(yǎng)相同時間，然后采用法進行計數(shù)，若結果較真實值偏小，原因是。

(4)與傳統(tǒng)構建重組質粒的方法相比，In-Fusion技術的優(yōu)勢有。(至少答出兩點)

11、金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動物肝臟細胞中的金屬結合蛋白，具有吸附重金屬的

作用?？蒲腥藛T將MT基因導入大腸桿菌構建工程菌，利用這一工程菌吸附工業(yè)廢水中的重金

屬?；卮鹣铝袉栴}：

⑴為獲取目的基因，從中提取mRNA,通過法獲得MTcDNA。MTcDNA的堿基

序列與細胞中MT基因的堿基序列（填“相同”或“不同”）。

⑵為了提高工程菌MT蛋白的產量，將MT基因與外源表達增強元件連接（圖甲表示引物對應

的位置）。

甲生念

---------1表達增強元碼_|MT基因|-------

（注：①、②③、④表示引物）②④

利用PCR檢測連接是否成功，可選擇的引物組合是（填字母），該PCR反應體系中需

加入酶。

A.①+③B.①+④C.③+②D.③+④

⑶將改造后的目的基因進行PCR擴增，得到的片段末端為平末端，而載體E只有能產生黏性

末端的酶切位點。為了能夠將MT基因與載體E相連，可以在上述引物的（填“5,

或“3，”）端添加能產生黏性末端的限制酶識別序列；也可以借助中間載體P將MT基因接入

載體E。（圖乙表示載體P和載體E的酶切位點及相應的酶切序列）

III

—CTCGAG——GATATC——CTGCAG——CCCGGG——GGTACC—

—GAGCTC——CTATAG——GACGTC——GGGCCC——CCATGG—

tTtPst1tt

價八EcoRVSmaITKpnIT

后者具體操作步驟如下:

①選用酶將載體P切開，再用DNA連接酶將MT基因與載體P相連,構成重組載體P'。

②載體P'不具有表達基因的和。選用酶組合對載體P'和載體

E進行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進行連接。為了提高獲得重組質粒的效

率，除了考慮適宜的外界條件、目的基因的濃度外，還需考慮（寫出兩點）。

（4）將重組質粒導入到用處理的大腸桿菌中完成轉化；利用含有的培養(yǎng)基篩

選出MT工程菌。

⑸通過檢測發(fā)現(xiàn)MT基因已經(jīng)成功導入大腸桿菌，但該菌不能吸附工業(yè)廢水中的重金屬，可能

的原因是：o

12、人絨毛膜促性腺激素（HCG）是女性懷孕后胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白，由a鏈和

B鏈（hCGB）結合而成。近年研究顯示，hCGB也可表達于結腸癌等多種惡性腫瘤細胞，與腫

瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移有一定關系。研發(fā)抗hCGB疫苗已成為近年來腫瘤生物治療新的熱點，

下圖1為其制備的基本方案。

登錄基因嗯離因

數(shù)嘉庫（630bp）

查詢h&B——?IAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIBI\重組酶、

基因序列\(zhòng)DNA?接酶環(huán)化導入-提取、鑒定工,

）I-畿大腸桿菌重組質粒

AOX1啟動子甲序列（320bp）/導入IV

0----------------

分離、提純檢測▼

.______線性質粒_______

H______）v~——1―制備成抗hCGB疫苗—發(fā)酵罐一—酵母菌

WV（組氨酸

氨芳青霉素抗性基因組氨酸合成酶基因缺陷型）

（注1：甲序列指導合成的信號肽能引導后續(xù)合成的肽鏈進入內質網(wǎng)腔

注2:AOX1為甲醇氧化酶基因的啟動子，只能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常表達）

圖1

（1）構建基因表達載體。圖中獲取hCG6基因的方法屬于.,hCGB基因需要與甲序列一

起構建形成融合基因，其目的是。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序

列相同時，在重組酶作用下發(fā)生同源切割，將目的基因直接插入。本方案中研究人員運用同源

切割的方式在hCGB基因兩端加上一組同源序列A、B,然后將hCGB基因與線性質粒載體混合

后，在重組酶和DNA連接酶的作用下可形成環(huán)化質粒。這一過程與傳統(tǒng)重組質粒構建過程相比,

無需使用的酶是O

⑵擴增基因表達載體。階段n將環(huán)化質粒導入用處理的大腸桿菌，然后在含有

的培養(yǎng)基中篩選得到含hCGB基因表達載體的大腸桿菌后進行擴增。

⑶鑒定基因表達載體。為了檢驗目的基因是否融合成功，提取大腸桿菌中的質粒為模板，設

計相應的引物對融合基因進行PCR,再將擴增產物進行電泳。電泳時需將待測樣品與上樣緩沖

液混合后加入加樣孔，緩沖液中含有的澳酚藍作為電泳指示劑，以防。電泳后得到圖

2所示結果，據(jù)圖可判斷號樣品最符合要求。

(4)導入受體細胞。階段IV時，需將處理后的酵母菌接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基不需要添

加以下哪些成分(A