發(fā)酵制藥技術(shù)

趙健存教學(xué)內(nèi)容

contents1.菌種選育2.菌種篩選教學(xué)目標(biāo)

targets1.了解自然選育的一般步驟2.熟悉誘變育種的工藝流程3.依據(jù)工藝流程，完成育種操作4.通過(guò)育種，了解生物安全微生物菌種是決定發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)價(jià)值以及發(fā)酵工程成敗的關(guān)鍵，只有具備良好的菌種基礎(chǔ)，才能通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵工藝和設(shè)備以獲得理想的發(fā)酵產(chǎn)品。

菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭

菌種是發(fā)酵技術(shù)核心之核心菌種選育菌種選育菌種選育菌種選育方法：自然選育誘變育種雜交育種-

原生質(zhì)體融合育種-植物基因工程育種自然選育

在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過(guò)程。自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。自發(fā)突變產(chǎn)生的頻率比較低，約為約10-9～10-6。自發(fā)突變：不利突變；有利突變；無(wú)義突變自然選育制備單孢子（單細(xì)胞）懸液適當(dāng)稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力、毒性測(cè)定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株自然選育優(yōu)點(diǎn)：

自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。缺點(diǎn)：

自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。誘變育種

誘變育種是指用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變，再?gòu)闹泻Y選出符合要求的突變菌株。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；速度快；收效大。目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來(lái)的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時(shí)的效價(jià)僅為20U/ml，通過(guò)多次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。誘變育種原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)胞計(jì)數(shù)誘變劑處理活細(xì)胞計(jì)數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩誘變預(yù)備處理誘變育種誘變育種出發(fā)菌種：用于誘變的原始菌種。選擇原則：對(duì)誘變劑敏感性強(qiáng)；容易發(fā)生變異；產(chǎn)量高。野生菌株采用具有有利性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)要求低等。由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會(huì)對(duì)其它誘變因素的敏感性提高，故有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株作為出發(fā)菌株。誘變育種誘變劑：凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。

如紫外線、X-射線、

-射線、快中子、超聲波等硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺、ICR類等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑誘變育種誘變效率：一般均采用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子懸液進(jìn)行誘變處理。1）分散狀態(tài)的細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑2）可避免長(zhǎng)出不純的菌落。誘變育種由于經(jīng)誘變處理后提高產(chǎn)量的變異株仍屬少數(shù)，所以必須經(jīng)過(guò)大量的篩選工作，才能得到需要的菌株。誘變育種抗噬菌體菌株的選育：穩(wěn)定性目標(biāo)代謝物產(chǎn)量抗性菌株與原始菌株的差別體內(nèi)基因重組育種體內(nèi)基因重組指重組過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，指采用的結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)使微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重組，以增加優(yōu)良性狀組合，從而獲得優(yōu)良菌株的一種方法。最主要的就是原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的融合再生融合子的檢出基因工程育種基因工程（geneticengineering)是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。該技術(shù)又稱為體外重組技術(shù)。

基因工程育種用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中，從而獲得新的菌種的一種育種方式。優(yōu)點(diǎn)：目的性強(qiáng)，效率高基因工程育種菌種篩選1.抗性菌株篩選2.生理生化特性篩選3.透明圈、變色圈、抑菌圈篩選4.高通量篩選方法：分子和細(xì)胞水平，靈敏、快速菌種篩選菌種篩選全細(xì)胞感應(yīng)菌與生產(chǎn)菌共培養(yǎng)的液滴微流控篩選方法WELCOME（whole-cellbiosensorandproducerco-cultivationbasedmicrofluidicplatformforscreeningactinomycetes），以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素為例，在液滴中建立大腸桿菌與放線菌共培養(yǎng)體系，將生產(chǎn)菌紅霉素的產(chǎn)