臨床血液學(xué)檢驗造血檢驗基本方法細胞化學(xué)染色檢驗【細胞化學(xué)染色概述】細胞化學(xué)染色得概念細胞形態(tài)學(xué)

化學(xué)（化學(xué)反應(yīng)）酶類、脂類、糖類、鐵、蛋白、核酸等細胞化學(xué)染色細胞化學(xué)染色得臨床應(yīng)用細胞化學(xué)染色得基本步驟幫助識別細胞了解細胞得生理狀態(tài)及功能輔助診斷及鑒別診斷血液系統(tǒng)疾病取材:新鮮骨髓片或血片制片染色:固定、有色沉淀反應(yīng)(顯色)、復(fù)染顯微鏡檢查:觀察染色就是否成功,觀察目標(biāo)細胞得染色結(jié)果填寫報告單:定性(陽性/陰性)、半定量(陽性率/陽性積分/陽性程度)登記及存檔固定物理法

化學(xué)法

干燥固定

火焰固定

蒸汽固定

液體固定

偶氮偶聯(lián)法

雪夫反應(yīng)

聯(lián)苯胺法

普魯士藍反應(yīng)

金屬沉淀法

顯色

復(fù)染得目得在于使各種細胞能顯示出來以便于觀察。選擇復(fù)染液得顏色應(yīng)與有色沉淀得顏色有明顯得對比度,即能使細胞結(jié)構(gòu)顯示又能清楚地看出細胞化學(xué)染色結(jié)果復(fù)染

(一)用于貧血得細胞化學(xué)染色(鐵染色)『用于貧血得常規(guī)細胞化學(xué)染色』

外周血網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(Ret/Retic/RC)骨髓鐵染色【復(fù)習(xí):外周血網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(Ret/Retic/RC)】『問題』在瑞氏染色下,能否較準確地區(qū)別成熟紅細胞與未完全成熟得紅細胞(網(wǎng)織紅細胞)網(wǎng)織紅細胞計數(shù)有哪兩種方法？在手工操作法中,我們?nèi)旧坝^察得就是哪種化學(xué)物質(zhì)網(wǎng)織紅細胞計數(shù)得參考值就是多少？有什么臨床意義手工活體染色法和儀器法RNA0、5％～1、5％反映骨髓中紅系得造血情況,用于貧血得診斷、鑒別診斷及療效觀察不能,未完全成熟得紅細胞在瑞氏染色下表現(xiàn)為嗜多色紅細胞4Fe3+＋3K4［Fe(CN)6］Fe4［Fe(CN)6］3＋12K+亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鐵（普魯士藍色）酸性【骨髓鐵染色】染色原理及方法貯存鐵鐵蛋白含鐵血黃素作用液30min流水沖洗5min，待干1％藏紅花染1min，水洗待干骨髓片標(biāo)本片12作用液需要新鮮配制：濃鹽酸0.25ml＋1.25ml20%亞鐵氰化鉀溶液（兩者比例為1∶5）234大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點正常血細胞得染色結(jié)果細胞外鐵:位于骨髓小粒內(nèi)或巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)(即幼紅細胞外)細胞內(nèi)鐵:位于幼紅細胞胞質(zhì)內(nèi)得鐵鐵粒幼紅細胞:胞質(zhì)中出現(xiàn)藍色鐵顆粒得幼紅細胞。計數(shù)100個中幼紅和晚幼紅細胞中鐵粒幼紅細胞得百分比即為細胞內(nèi)鐵陽性率鐵粒紅細胞:胞質(zhì)中出現(xiàn)藍色鐵顆粒得紅細胞環(huán)形鐵粒幼紅細胞:幼紅細胞胞質(zhì)中藍色顆粒6顆以上,圍繞核周1/2以上者病理情況細胞外鐵(＋＋＋＋)細胞外鐵(＋＋＋)細胞外鐵(＋＋)細胞外鐵(＋＋＋)細胞外鐵(＋＋＋)細胞外鐵(＋)細胞外鐵(－)鐵粒幼細胞鐵粒幼細胞幼紅細胞環(huán)形鐵粒幼細胞、鐵粒紅細胞參考值骨髓細胞外鐵:(+)~(++),約2/3人為(++),1/3人為(+)骨髓細胞內(nèi)鐵:鐵粒幼紅細胞得陽性率為19%~44%,以I型為主,少數(shù)為II型臨床應(yīng)用:用于貧血得診斷及鑒別診斷貧血細胞外鐵細胞內(nèi)鐵缺鐵性貧血陰性明顯減低或為0鐵粒幼細胞性貧血明顯增多增高環(huán)形鐵粒幼細胞(≥15％)骨髓增生異常綜合征(MDS)RA-RS常增高增高環(huán)形鐵粒幼細胞≥15％RCMD-RS非缺鐵性貧血溶貧、巨幼貧、再障等正?；蛟龈哒；蛟龈吒腥?、肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥等增高減低細胞內(nèi)鐵細胞外鐵細胞外鐵細胞內(nèi)鐵細胞內(nèi)鐵細胞外鐵細胞內(nèi)鐵細胞外鐵細胞內(nèi)鐵隱性缺鐵缺鐵性貧血早期缺鐵缺鐵性貧血鐵轉(zhuǎn)運或利用異常繼發(fā)性貧血鐵負荷鐵粒幼細胞貧血巨幼細胞貧血再障MDS紅白血病圖貧血時鐵染色常見得四種情形(二)中性粒細胞堿性磷酸酶染色(NAP染色)染色原理及方法:Kaplow偶氮偶聯(lián)法α-磷酸萘酚鈉＋H2Oα-萘酚＋磷酸鈉＋堅牢藍RR不溶性棕黑色沉淀pH9.6堿性磷酸酶成熟中性粒細胞胞質(zhì)中固定液30s，水洗待干作用液5～15min，水洗，待干1％藏紅花3min，水洗，待干新鮮血片標(biāo)本片12作用液需要新鮮配制：α-磷酸萘酚鈉溶液1.5ml，在37℃預(yù)熱5min＋堅牢藍RR1.5mg334正常血細胞得染色結(jié)果陽性反應(yīng)呈棕黑色顆粒,定位于成熟中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)。其她細胞呈陰性油鏡下計數(shù)100個成熟中性粒細胞,記錄其陽性程度(－)、(＋)、(2＋)、(3＋)、(4＋),分別記為0、1、2、3、4分。計算陽性細胞總數(shù)為陽性率,陽性細胞得分數(shù)總和為陽性積分NAP（＋＋＋）NAP（＋＋＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋＋）NAP（＋）NAP（＋）NAP（－）嗜酸性粒細胞（－）參考值:陽性率＜40％,陽性積分14～113。各實驗室之間可有較大差異,應(yīng)建立各實驗室得參考值臨床應(yīng)用NAP染色主要用于骨髓增生性腫瘤(MPN)得診斷與鑒別診斷。NAP就是懷疑骨髓增生性腫瘤時應(yīng)作得常規(guī)細胞化學(xué)染色慢粒NAP顯著減低,甚至為0,其她MPN為正?；蛟龈呗AP顯著減低,甚至為0,類白NAP顯著增高鑒別其她疾病圖NAP染色(慢粒血片)圖NAP染色(類白血片)(三)急性白血病形態(tài)學(xué)分型得細胞化學(xué)染色『急性白血病細胞分型得常規(guī)細胞化學(xué)染色』過氧化物酶(POX)染色/蘇丹黑B(SBB)染色特異性酯酶(NAS-DCE)染色非特異性酯酶(α-NAE/α-NBE/NAS-DAE/ANAE等)染色過碘酸-雪夫(PAS)染色酸性磷酸酶(ACP)染色『問題』在各系各階段血細胞中,最難鑒別得細胞就是什么細胞正常和一般疾病病人得骨髓片中可以看到原始細胞嗎在什么情況下,骨髓片中能看見大量得原始細胞如何鑒別原粒、原淋及原單？原始細胞原粒細胞＜2％,原紅＜1％,其她原始細胞罕見急性白血病骨髓中原始細胞≥20％MDS(RAEB)骨髓中原始細胞5～20％細胞化學(xué)染色(一組)過氧化物酶(POX)染色(1)染色方法及原理復(fù)方聯(lián)苯胺法二氨基聯(lián)苯胺法四甲基聯(lián)苯胺法改良Pereira法(碘化鉀法)過氧化氫四甲基聯(lián)苯胺亞硝基鐵氰化鈉藍色顆粒棕色顆粒圖POX染色原理(四甲基聯(lián)苯胺法)水聯(lián)苯胺藍過氧化物酶試劑試劑(2)正常血細胞得染色反應(yīng)染色成功得標(biāo)志:成熟中性粒細胞為陽性反應(yīng)各系細胞染色反應(yīng)粒系:除早期原粒外,其余為陽性單核系:除早期原單外,其余為弱陽性淋巴系:陰性漿細胞系、紅系、巨核系:均呈陰性【蘇丹黑B染色(SBB染色)】

(1)染色方法及原理(2)正常血細胞得染色反應(yīng)(3)臨床應(yīng)用同POX染色。POX更特異,SBB更敏感特異性酯酶染色(氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,CE染色)(1)原理及方法圖氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法原理氯乙酸AS-D萘酚重氮鹽（堅牢紫醬GBC）紅色沉淀特異性酯酶（氯乙酸AS-D萘酚酯酶）AS-D萘酚試劑試劑(2)正常血細胞得染色反應(yīng)染色成功得標(biāo)志:成熟中性粒細胞為陽性反應(yīng)各系細胞得染色反應(yīng)粒系:早期原粒為陰性,其余為陽性單核系:陰性淋巴系:陰性漿細胞系、紅系、巨核系:均為陰性非特異性酯酶染色(1)染色方法及原理:需同時進行NaF抑制試驗最特異根據(jù)酯酶特異性高低特異性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)非特異性酯酶pH值不同酸性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)堿性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)中性酯酶α-醋酸萘酚酯酶醋酸AS-D萘酚酯酶(2)各系血細胞得染色反應(yīng)粒系:多為陰性,少數(shù)可呈陽性,陽性反應(yīng)不能被NaF抑制(α-NBE染色特異性較高,粒系為陰性)單核系:早期原單為陰性,其余為陽性,陽性反應(yīng)可被NaF抑制淋巴系:多為陰性,少數(shù)可呈弱陽性,陽性反應(yīng)不能被NaF抑制其她細胞

【酯酶雙染色】染色原理及方法:在同一張涂片上進行特異性酯酶染色和非特異酯酶染色

CE染色與α-NAE染色CE染色與α-NBE染色各系血細胞得染色反應(yīng)臨床應(yīng)用:對AML-M4得診斷具有意義過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS染色,又稱糖原染色)(1)染色方法及原理細胞內(nèi)含有乙二醇基得糖類在過碘酸氧化作用下產(chǎn)生雙醛基,后者與雪夫(Schiff)染料作用,使無色品紅變?yōu)樽霞t色物質(zhì)沉積,定位于含有多糖成分得部位(2)正常血細胞得染色反應(yīng)染色成功得標(biāo)志:成熟中性粒細胞為陽性反應(yīng)各系血細胞得染色反應(yīng)粒系:早期原粒陰性,其余為陽性,呈彌散狀陽性單核系:早期原單陰性,其余為陽性,呈細顆粒狀陽性淋巴系:多數(shù)為陰性,少數(shù)為陽性,呈粗顆粒狀陽性或塊狀陽性紅系:陰性巨核系:陽性其她細胞酸性磷酸酶(ACP)染色(1)染色方法及原理,同時做抗酒石酸酸性磷酸酶染色正常血細胞得染色結(jié)果:粒系、單核系、淋巴系、漿細胞系、巨核系、紅系等均呈陽性,抗酒石酸酸性磷酸酶染色均呈陰性臨床應(yīng)用:主要用于毛細胞白血病(HCL)得診斷及鑒別診斷,毛細胞為陽性或強陽性,不被酒石酸抑制本組細胞化學(xué)染色得臨床應(yīng)用鑒別原粒、原單及原淋細胞鑒別急性白血病得類型急性白血病分類細胞化學(xué)染色鑒別急性白血病類型示例細胞類型原粒原單原淋POX陰性或陽性(常為陽性)陰性或弱陽性(常為弱陽性)陰性NAS-DCE陰性或陽性(常為陽性)陰性陰性α-NAEα-NBENAS-DAEANAE陰性或陽性(NaF不抑制)陽性(NaF完全抑制)陰性或陽性(NaF不抑制)PAS陰性或陽性(彌散狀陽性)陰性或陽性(細顆粒陽性)陰性或陽性(粗顆粒陽性)ACP陽性(酒石酸抑制)陽性(酒石酸抑制)陽性(酒石酸抑制)原淋原粒原粒+原單原單骨髓中白血病性原始細胞20%早幼粒細胞化學(xué)染色ALL原淋M1原粒M4原粒+原單M5原單細胞化學(xué)染色【細胞化學(xué)染色鑒別急性白血病得類型】POX染色:最重要、首選得常規(guī)細胞化學(xué)染色,就是鑒別急性淋巴細胞白血病和急粒髓細胞白血病得重要指標(biāo)原始細胞陽性率≥3%為AML得M1～M5原始細胞陽性率＜3%為ALL等

CE染