(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局地址410083湖南省長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)麓山南(72)發(fā)明人楊力芳周琴屈春輝通合伙)43114專利代理師袁靖A61K45/00(2006.01)A61K31/7088(2006.01)A61P35/00(2006.01)抑制或檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用以及鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物和預(yù)后制劑了一種抑制或檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miR-3150a-5p在鼻咽癌轉(zhuǎn)移患者血AUC曲線下面積為0.84,診斷靈敏度可達(dá)78%,特異度可達(dá)83%。證實(shí)miR-3150a-5p在鼻咽癌患者預(yù)后中具備良好的應(yīng)用前景。另外，發(fā)現(xiàn)敲低miR-3150a-5p會(huì)顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中miR-3150a-5p的表達(dá)量且能有效抑inhibitor靶向敲低miR-3150a-遷移侵襲21.抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用，其特征在于，用于制備鼻咽癌治療藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，miR-3150a-5pinhibitior序列為4.一種鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物，其特征在于，包括抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)的試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物，其特征在于，所述的抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑包括miR-3150a-5pinhibitior。7.檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用，其特征在于，用于制備鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)后8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)的試9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR檢測(cè)試劑中的擴(kuò)增引物序列：上10.一種鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)后制劑，其特征在于，包括檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)的試3抑制或檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用以及鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物和預(yù)后制劑技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抑制或檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用以及鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物和預(yù)后制劑。背景技術(shù)[0002]鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)發(fā)生于鼻咽粘膜上皮，是頭頸部最為常[0003]世界衛(wèi)生組織將NPC定義為三種類型：角化性、非角化性鱗狀細(xì)胞癌和未分化或低分化癌。其中，非角化亞型鼻咽癌占流行地區(qū)腫瘤的95%以上。由于病變?cè)缙诎Y狀不明顯，且NPC具有高度侵襲性和高轉(zhuǎn)移潛能，70%以上的患者初診即發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約20-30%的死亡率以及提高5年總生存率，但發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的治療效果仍然不理想，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是目前臨床治療失敗的主要原因。[0004]外泌體是幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞都會(huì)分泌的杯狀雙層膜小囊泡，在血液等體液內(nèi)傳播，可以通過(guò)直接與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，直接被釋放到生物體液中，將內(nèi)容物傳遞至受體細(xì)胞中影響其生物功能。腫瘤外泌體攜帶來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)信息(蛋白、DNA和microRNA等),其內(nèi)容物的濃度與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力及腫瘤微環(huán)境相關(guān)，通過(guò)分析外泌體的表面標(biāo)記或內(nèi)部成分可以直接獲得細(xì)胞的基本信息。由于外泌體有脂質(zhì)膜保護(hù)，其內(nèi)容物不易被降解破壞，使得無(wú)論新鮮的還是長(zhǎng)期保存的樣本皆可用于分析。miRNA存在于外泌體內(nèi)容物中，可以通過(guò)外泌體的包裹從腫瘤細(xì)胞釋放到體液中，不會(huì)受到核糖體酶的降解。更重要的是，外泌體可以從眾多體液中獲得(血液、尿液等),這使得外泌體檢測(cè)在腫瘤診療[0005]因此，迫切需要開發(fā)新的可靠的非侵入性早期轉(zhuǎn)移診斷預(yù)后標(biāo)記物，促進(jìn)鼻咽癌的早期精準(zhǔn)干預(yù)和治療，延長(zhǎng)鼻咽癌患者的生存期。專利申請(qǐng)CN118086492A公開了miR-376a-5p在鼻咽癌患者血液中的表達(dá)水平顯著高于健康人群，可作為鼻咽癌診斷的miRNA標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)。本發(fā)明不僅僅是開發(fā)了一種新的鼻咽癌診斷預(yù)后標(biāo)記物miR-3150a-5p,且來(lái)源為外泌體，不同于該專利申請(qǐng)的血液來(lái)源的標(biāo)記物。發(fā)明內(nèi)容[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了抑制或檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用以及鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物和預(yù)后制劑。本發(fā)明是通過(guò)外泌體miR-3150a-5p作為預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物，通過(guò)分析其表達(dá)量即可快速實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的輔助預(yù)后檢測(cè)。且miR-3150a-5p可作為治療靶點(diǎn)，靶向抑制其表達(dá)可實(shí)現(xiàn)鼻咽癌患者的治療，具有較廣的應(yīng)用前景。4[0007]本發(fā)明所述miR-3150a-5p的核苷酸序列為[0008]本發(fā)明的目的之一是提供抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用，用于制備鼻咽癌治療藥物。[0009]進(jìn)一步地，[0010]所述的抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑包括miR-3150a-5pinhibitior。[0011]更進(jìn)一步地，[0012]miR-3150a-5p[0013]本發(fā)明的目的之二是提供一種鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療藥物，包括抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)的試劑。[0014]進(jìn)一步地，[0015]所述的抑制外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑包括miR-3150a-5pinhibitior。[0016]更進(jìn)一步地，[0017]miR-3150a-5p[0018]本發(fā)明的目的之三是提供檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑的應(yīng)用，用于制備鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)后制劑。通過(guò)檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p在鼻咽癌患者中的表達(dá)水平以輔助診斷和/或評(píng)估鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。[0019]進(jìn)一步地，[0020]所述的檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)的試劑，包括PCR檢測(cè)試劑。[0021]更進(jìn)一步地，[0022]所述的PCR檢測(cè)試劑中的擴(kuò)增引物序列：上游引物為[0023]優(yōu)選地，所述檢測(cè)樣本為血清外泌體。[0024]本發(fā)明的目的之四是提供一種鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)后制劑，包括檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑。[0025]所述的檢測(cè)外泌體miR-3150a-5p表達(dá)試劑包括PCR檢測(cè)試劑。[0026]更進(jìn)一步地，[0027]所述的PCR檢測(cè)試劑中的擴(kuò)增引物序列：上游引物為下游引物為CAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC。[0028]優(yōu)選地，所述檢測(cè)樣本為血清外泌體。[0029]本發(fā)明通過(guò)臨床血清外泌體miRNA測(cè)序和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-3150a-5p在鼻咽癌轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移患者，其可以作為預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后的可靠標(biāo)志物。[0030]本發(fā)明通過(guò)特異性擴(kuò)增miR-3150a-5p的試劑盒和血清樣本檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移的快速輔助診斷，且經(jīng)計(jì)算分析AUC曲線下面積達(dá)0.84,靈敏度78%,特異度83%。[0031]本發(fā)明設(shè)計(jì)了基于miR-3150a-5p的抑制劑序列靶向敲低該miRNA能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，表明其具有開發(fā)為治療鼻咽癌藥物的潛力。[0032]檢測(cè)血清外泌體中miR-3150a-5p表達(dá)水平，用于鼻咽癌轉(zhuǎn)移的輔助診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)?；谠搈iRNA的引物設(shè)計(jì)、試劑盒開發(fā)及其在臨床診斷中的具體應(yīng)用。通過(guò)miR-3150a-55p的特異性抑制劑序列，抑制其表達(dá)以治療鼻咽癌。包含使用miRNAinhibitor或其他載體(如核酸藥物、生物活性片段)的藥物開發(fā)和治療應(yīng)用。[0033]本發(fā)明可能的變更設(shè)計(jì)方向或者變形方案：[0035]可能會(huì)以miR-3150a-5p與其他miRNA的組合(如多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè))取代單一miRNA的診斷功能，以提升靈敏度和特異度。[0036](二)樣本來(lái)源改進(jìn)[0037]本發(fā)明基于血清外泌體樣本檢測(cè)，可能的變形包括利用其他生物樣本如唾液、尿[0038](三)替代抑制劑設(shè)計(jì)[0039]本發(fā)明利用miR-3150a-5pinhibitor序列抑制該miRNA,還可能設(shè)計(jì)小分子化合物、反義寡核苷酸(ASO)、siRNA等其他形式的miRNA抑制[0040]本發(fā)明有益效果[0041]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miR-3150a-5p在鼻咽癌轉(zhuǎn)移患者血清外泌體中的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)移患者，且經(jīng)計(jì)算分析AUC曲線下面積為0.84,miR-3150a-5p的診斷靈敏度可達(dá)到78%,特異度可達(dá)83%。證實(shí)miR-3150a-5p基因在鼻咽癌患者診斷預(yù)后中具備良好的應(yīng)用前景。另外，發(fā)現(xiàn)敲低miR-3150a-5p會(huì)顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中miR-3150a-5p的表達(dá)量且能有效抑制鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展。上述發(fā)現(xiàn)表明miR-3150a-5p對(duì)鼻咽癌的重要性，并提示采用miRNAinhibitor靶向敲低miR-3150a-5p進(jìn)行鼻咽癌治療的可行性。附圖說(shuō)明[0042]圖1:5例高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和5例低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)鼻咽癌患者血清外泌體中miRNA測(cè)序分析[0043]圖1A:鼻咽癌患者血清樣本外泌體中miRNA測(cè)序的散點(diǎn)圖；圖1B:鼻咽癌患者血清樣本外泌體miRNA測(cè)序中最明顯的8個(gè)上調(diào)和4個(gè)下調(diào)miRNA表達(dá)量的分析；圖2A:TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)頭頸部腫瘤(HNSC)中候選外泌體miR-205-5p表達(dá)進(jìn)行總體生存分析；圖2B:TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)頭頸部腫瘤(HNSC)中候選外泌體miR-885-5p表達(dá)進(jìn)行總體生存分析；圖2C:TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)頭頸部腫瘤(HNSC)中候選外泌體miR-3150a-5p表達(dá)進(jìn)行總體生存分析；[0046]圖4:外泌體miR-3150a-5p區(qū)分轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者與未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的受試者工作特征(ROC曲線);[0047]圖5:miR-3150a-5pinhibitor處理前后鼻咽癌細(xì)胞5-8F中miR-3150a-5p基因的表達(dá)；[0048]圖6:miR-3150a-5pinhibitor處理前后鼻咽癌細(xì)胞5-8F增殖能力分析；[0049]圖7:miR-3150a-5pinhibitor處理前后鼻咽癌細(xì)胞5-8F遷移及侵襲能力分析。6風(fēng)險(xiǎn)(初診無(wú)轉(zhuǎn)移，且根治性治療后隨訪未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā))鼻咽癌患者的初診血清標(biāo)本，主；分組依據(jù)有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中轉(zhuǎn)移組需明確存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)(如影像學(xué)或組織學(xué)診斷),非轉(zhuǎn)移組需無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；所有病例的基患者診斷為鼻咽癌，但尚未接受任何放化療及手術(shù)治療時(shí)收集的。干冰運(yùn)載至Ribo差異，紅色點(diǎn)表示在轉(zhuǎn)移NPC患者血清中上臨床病理病例性別TNM分期未轉(zhuǎn)移病例1女未轉(zhuǎn)移病例2女未轉(zhuǎn)移病例3男未轉(zhuǎn)移男未轉(zhuǎn)移病例5男轉(zhuǎn)移女肺轉(zhuǎn)移病例7男結(jié)、骨轉(zhuǎn)移病例8男肝轉(zhuǎn)移男肺轉(zhuǎn)移女利用TCGA(TheCancerGenomeAtlas)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)頭頸部鱗癌(HNSC)患者樣本進(jìn)行7存時(shí)間和miRNA表達(dá)量作為分析指標(biāo)。根據(jù)miRNA表達(dá)水平(高表達(dá)組與低表達(dá)組)進(jìn)行分組，表達(dá)量的高低以中位數(shù)為分界。使用Kaplan-Meier生存分析方法對(duì)患者的總生存時(shí)間進(jìn)行評(píng)估，生存曲線通過(guò)GraphPadPrism9.5軟件繪制。[0058]進(jìn)一步的生存分析顯示，miR-205-5p和miR-885-5p高表達(dá)的患者其總生存時(shí)間較長(zhǎng)，提示其高表達(dá)與較好的預(yù)后呈正相關(guān)；而miR-3150a-5p高表達(dá)的患者其總生存時(shí)間顯步通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miR-3150a-5p表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR-3150a-5p在頭頸部鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織(P<0.05)(圖3)。[0059]實(shí)施例3miR-3150a-5p基因在大規(guī)模鼻咽癌患者中診斷價(jià)值分析：[0061]另外收集59例高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)(初診無(wú)轉(zhuǎn)移，但在根治性治療后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)60例低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)(初診無(wú)轉(zhuǎn)移，且根治性治療后隨訪未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā))鼻咽癌患者的初診血清標(biāo)臨床病理轉(zhuǎn)移(%)未轉(zhuǎn)移(%)總計(jì)性別男女腫瘤分期區(qū)域淋巴結(jié)分期[0064]將血清從冰箱中拿出，置于冰上解凍，加入1/3體積的RiboTM血清外泌體提取試劑，渦旋混勻；4°℃靜置60min后，12000g于4℃離心20min,管底應(yīng)有肉眼可見的黃白色沉淀，小心吸除全部上清液；向離心管中加入適量PBS溶液，混勻所得即為富含外泌體的溶液。收集的外泌體沉淀中加入內(nèi)參cel-miR-39-3p,在超凈工作臺(tái)中加入1mL試劑盒中的總RNA提取試劑TRnaZolReagent,靜置2min,吹打均勻后移至新的1.5mLEP管中，后續(xù)步驟相同；向上述溶液中加入1/5的RNAExtractionBuffer,劇烈振蕩15s,顯示液體8為均一的粉紅色，室溫靜置5min,12000g于4℃離心20min,觀察到最下層為粉紅色有機(jī)相、中間層為白色物質(zhì)，最上層為無(wú)色水相。將上層水相盡量都轉(zhuǎn)移至新酶的EP管中；在得到的無(wú)色水相的EP管中，加入與無(wú)色水相等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置15min,12000g于4°℃離心15min,小心吸棄上清，在管底可以觀察到半透明狀沉淀，即提取到的RNA;使用DEPC處理的無(wú)菌ddH?0配制75%乙醇洗滌沉淀，加入與使用的TRnaZolReagent等體積的75%乙醇，8000g于4°℃離心5min。吸棄上清，室溫10min晾干沉淀。加入20-50μL的RNase-FreeWater,充分溶解RNA,測(cè)濃度后將樣品[0067](四)實(shí)時(shí)定量PCR[0068]通過(guò)Mir-XmiRNAFirst-StrandSynthesisKit(638315,TaKaRa)將從血清中提cDNA(10ng/μL),并根據(jù)制造商的使用說(shuō)明在CFX96RealTimeSystem(Bio-Rad)實(shí)時(shí)定量PCR平臺(tái)中進(jìn)行。首先進(jìn)行95℃10分鐘預(yù)變性，接著進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，條件為1)95℃2秒，引物序列(5′-3')hsa-miR-3150a-5p-正向引物本實(shí)施例中對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的所有受試者進(jìn)行了隨機(jī)分組，按7:3的比例將所有受試者分為訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列。并進(jìn)行AUC曲線下面積計(jì)算其敏感度和特異度。結(jié)果如圖4所為0.84,其診斷靈敏度可達(dá)到78%,特異度達(dá)83%。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實(shí)miR-3150a-5p在鼻咽癌患者早期轉(zhuǎn)移診斷中具備良好的應(yīng)用前景。[0071]實(shí)施例4抑制miR-3150a-5p的表達(dá)量對(duì)鼻咽癌改善情況分析：[0073]人高轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞5-8F在含10%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)液中進(jìn)行活化處理，37℃,5%CO?條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，備用。[0074](二)試驗(yàn)方法[0075](1)miR-3150a-5pinhibitor片段設(shè)計(jì)：在廣州銳博公司合成siRNA序列，其中inhibitor序列為GCUGAGGAGAUCGUCGAGGUUG;陰性對(duì)照序列為CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA。[0076](2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)組：向5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3150a-5pinhibitor,對(duì)照組轉(zhuǎn)染ncinhibitor,轉(zhuǎn)染根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液。9[0077](3)抑制效率驗(yàn)證：1)細(xì)胞水平：使用NcmSpinCell/TissueTotalRNAKit(M5101,NCMBiotech)提取細(xì)胞總RNA,具體分析方法可參見試劑盒說(shuō)明書。2)外泌體水平：細(xì)胞外泌體提取：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)上清，2000g于4℃離心15min,轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入1/4外泌體提取試劑(EXOTC10A-1,SBI),渦旋混勻。4℃靜置4h后，13000rpm于4℃離心60min,除TotalRNAKit(M5101,NCMBiotech)提取外泌體總RNA,具體分析方法可參見試劑盒說(shuō)明書。分別按照上述步驟提取細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體的RNA,隨后按照實(shí)施例3中實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體的miR-3150a-5p表達(dá)水平。[0078](4)細(xì)胞增殖能力分析：采用cck8細(xì)胞增殖試劑盒(CO005,Targetmol)分析轉(zhuǎn)染inhibitor前后的5-8F的增殖能力。具體分析方法可參見試劑盒說(shuō)明書。[0079](5)細(xì)胞侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染inhibitor48h后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。在未鋪和預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液(含無(wú)血清培基RMPI-16