牛環(huán)形泰勒蟲病防治技術(shù)規(guī)程2015-12-30實(shí)施2015-12-30實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編制。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：巴音查汗·蓋力克、郭慶勇、王振寶、張楊、王冰潔、伊春陽、李永暢、朱玉1本標(biāo)準(zhǔn)適用于養(yǎng)牛場(戶)、動物診療機(jī)構(gòu)和動物防疫防控機(jī)構(gòu)對牛環(huán)形泰勒蟲病的防控。牛環(huán)形泰勒蟲病(Bovinetheileriosis),是由泰勒蟲屬的環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)寄生于動物紅細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、器官而引起的一種蜱傳血液原蟲病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其定為環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata),隸屬于原生配子體寄生于紅細(xì)胞，其形態(tài)為環(huán)形、戒指狀(70%～80%)、橢圓形、逗點(diǎn)狀、桿狀、十字形裂殖體又稱石榴體或柯赫氏藍(lán)體(koch'sbluebodies),寄生于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞的胞漿內(nèi)或散在于細(xì)胞外，呈圓形、腎形或者橢圓形(詳見附錄E.3)。2而感染(詳見附錄F)。傳播牛梨形蟲的硬蜱有3屬8種，其中新疆已被證實(shí)的媒介蜱為小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱(詳見附錄G)。在差異，每年5月中旬開始出現(xiàn)，但因當(dāng)年氣溫的升高或降低也會出現(xiàn)上下浮動，(6～7)月達(dá)高峰， (8～9)月逐漸平息；耐過牛的免疫力可持續(xù)(2.5~6)年，長期“帶蟲”;據(jù)報道該病在我區(qū)的感染率可達(dá)60%,其急性病例死亡率較高。體溫升高至39℃~41.8℃,達(dá)42℃,呈稽留熱，少數(shù)病牛呈弛張熱或間歇熱。淋巴結(jié)腫大有痛感，柯赫氏藍(lán)體(石榴體),此期可延續(xù)2d～5d。深紅色結(jié)節(jié)狀的溢血斑點(diǎn)，趨于死亡征兆，死亡常發(fā)生在發(fā)病后的(1～2)周；耐過的牛，若能得到良膜有出血點(diǎn)；嚴(yán)重病例粘膜病變面積可占1/2以上；尸僵明顯，尸體消瘦，全身皮病原學(xué)診斷包括血液型蟲體的鑒定和組織型蟲體(網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)蟲體)的鑒定。3經(jīng)血液涂片染色，在顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)血液型蟲體是確診的主要依據(jù)(鏡檢方法見附錄A)。鏡下觀察到與附錄E.1、E.2相同蟲體即可確該病的初期，蟲體一般侵襲患病宿主的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(淋巴結(jié)、脾臟等),檢查發(fā)現(xiàn)臟器型蟲體也集的蜱蟲放入相應(yīng)編號的采集管內(nèi)，以平均只數(shù)/牛個數(shù)計算密度(詳見附錄B)。送回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行鑒定媒介蜱種類及檢測其攜帶的病原。如發(fā)等野外采集蜱蟲時常用布旗法、獸皮法采集(詳見附錄B);在牛體表、周圍環(huán)境及植被中發(fā)現(xiàn)媒介蜱蟲(詳見附錄G)是確診的主要依據(jù)。3.6牛環(huán)形泰勒蟲病PCR診斷根據(jù)PCR檢測結(jié)果判定(詳見附錄C)。按(3.5～7)mg/kg,用生理鹽水稀釋成5%溶液，按(4～6)mg/kg分點(diǎn)深部肌肉注射，每個注射點(diǎn)不應(yīng)超過1g,每日1次，連用3d;48h后重復(fù)用藥。按(0.75～1.5)mg/kg,每日口服一次，連用3d。4按(4～8)mg/kg,加水灌服，首次倍量，每隔12h重復(fù)1次。每日每頭牛2kg～3kg,分兩次口服，用法：將青蒿切碎，用冷水浸泡1h～2h,然后連渣灌服，連服3d。對于食欲減退牛灌服促反芻散，每頭灌服150g～300g,每天灌服1次；心力衰竭牛肌注10%安鈉加；血尿牛注射20mL0:5%的安絡(luò)血。對于病情較嚴(yán)重的牛，采用輸血療法，取健康奶牛血液300ml～500ml,靜脈輸入病牛體內(nèi)，每天在流行區(qū)的發(fā)病季節(jié)，用黃色素(參考4.2.1)和貝尼爾(參考4.2.2)給牛進(jìn)行藥物預(yù)防注射。圈(防圈舍蜱)和避開媒介蜱孳生地放牧。每年(3～6)月為我區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲病高發(fā)季節(jié)，每月采集牛血和環(huán)境周圍的媒介蜱提取DNA后，采用3.6給出的檢測方法進(jìn)行檢測，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)陽性病例及時治療；同時每年在發(fā)病季節(jié)，采用5.2的方55.2.3提高宿主牛的抗病能力對患病牛，改善飼養(yǎng)環(huán)境，完善圈舍衛(wèi)生、防蜱措施和護(hù)理；對非疫區(qū)、疑似牛采取綜合防御措施，加強(qiáng)驅(qū)蟲保健。6(規(guī)范性附錄)病原學(xué)診斷方法A.1血液型蟲體鑒定方法A.1.1主要設(shè)備、材料和試劑冰箱、離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡、體視顯微鏡、移液器、吸頭、離心管、載玻片；無菌注射器或真空采血管、EDTA溶液、抗凝劑、染色液等。A.1.2血液樣品采集從疑似牛類動物耳尖或尾根部無菌采血約10ml,分別加入到含有抗凝劑EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝劑的采血管內(nèi)(用于分離血清),-20℃保存待檢。A.1.3溶液配制A.1.3.1姬姆薩染液：見附錄DA.1.4操作方法A.1.4.1取采集的血液樣品1滴，將血液置載玻片一端，另取一張邊緣光滑的推片，讓推片邊緣和血液接觸，使血液全部與推片邊緣重合散開，推片和載玻片保持30°角，向前平穩(wěn)均勻推動推片，載玻片上便留下一層薄血膜。A.1.4.2血涂片制成后，待血膜自然干燥后，在血膜表面滴加甲醇進(jìn)行固定。A.1.4.3待甲醇在空氣中干燥后，對血膜進(jìn)行染色。將姬姆薩染液滴加在血膜上，使血膜被染液覆蓋，染色30min。A.1.4.4染色30min后，用清水輕輕洗去載玻片表面的染液，待載玻片表面干燥后用鉛筆或標(biāo)簽紙在血膜的另一側(cè)進(jìn)行編號。A.1.5顯微鏡下檢查在干燥后的血膜表面滴加一滴松柏油，將血膜放在100倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)鏡下發(fā)現(xiàn)與附錄E相同的典型血液型蟲體即可判定為陽性。A.2組織型蟲體鑒定方法A.2.1主要設(shè)備、材料和試劑參見A.1.1。A.2.2活體和死亡牛淋巴、組織樣品從疑似牛類動物的肩前淋巴結(jié)或腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行無菌穿刺，用干燥注射器抽取淋巴內(nèi)容物；也可無菌采集淋巴結(jié)、脾臟等用于制作抹片樣品。病死動物采樣時，死亡時間不超過24h,采集腦、淋巴結(jié)、心、肝、和脾等臟器組織樣品，樣品在4℃左右條件下迅速送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。A.2.3溶液配制7A.2.4操作方法A.2.4.1將載玻片輕輕觸碰臟器切面或輕推淋巴液使淋巴液在玻片上形成一張薄的膜。A.2.4.2涂抹片制成后，待自然干燥后，在涂抹片表面滴加甲醇進(jìn)行固定。A.2.4.3待甲醇在空氣中干燥后，對涂抹片進(jìn)行染色。將姬姆薩染液滴加在血膜上，使涂抹片被染液覆蓋，染色30min。A.2.4.4染色30min后，用清水輕輕洗去載玻片表面的染液，待載玻片表面干燥后用鉛筆或標(biāo)簽紙在涂抹片的另一側(cè)進(jìn)行編號。A.2.5顯微鏡下檢查在干燥后的涂抹片表面滴加一滴松柏油，將血膜放在100倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)鏡下發(fā)現(xiàn)與附錄E相同的典型“石榴體”即可判定為陽性。8(規(guī)范性附錄)牛體重估測法及媒介蜱的采集法B.1體重估測公式=胸圍2(m2)×體長(m)×90=體重(kg)(注明：胸圍是從肩胛后角圍繞胸圍一周的長度；90指成年牛系數(shù)。)B.2布旗法(人工小時布旗法):用1m2大小的白絨布旗，在有媒介蜱地帶進(jìn)行定時拖蜱。操作時，手持旗桿伸向一側(cè)，使旗子平鋪于草叢上，以等速緩步向前行，每步行10m停下觀察一次，將附于旗上的蜱撿入采集瓶內(nèi)。每面旗子整個過程共進(jìn)行1h。B.3媒介蜱種群組成(優(yōu)勢種群)(Dr)=(Ni/N)×100%(N為家畜體表寄生蜱總個體數(shù)，Ni為某種蜱的個體數(shù));B.4獸皮法：用屠宰動物的新鮮皮(牛、羊等動物皮，粘膜面朝上，被毛面朝下)代替布旗，在有媒介蜱地帶進(jìn)行定時拖蜱。拖皮行走每隔50m～100m檢查一次獸皮，收集其上黏貼的蜱蟲。一般2月下旬開始發(fā)病，3月～4月達(dá)到高峰，5月逐漸減少，9月可二次流行。南北疆發(fā)病時間稍有差異，一般北疆較南疆晚；馬泰勒蟲病的流行季節(jié)較駑巴貝斯蟲病稍晚，但兩者常呈混合感染。9(規(guī)范性附錄)從疑似牛類動物耳尖或尾根部無菌采血約10ml,分別加入到含有抗凝劑EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝劑的采血管內(nèi)(用于分離血清),-20℃保存待檢。提取核酸(詳見附錄C),-20℃保存待檢。25μL反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系10×PCRbuffer(不含Mg2)-5324上游引物F112下游引物R112PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,退火時間為1min,72℃延伸1min,30個循環(huán)；72℃延伸10min,4℃設(shè)計陽性對照(牛環(huán)形泰勒蟲DNA)、陰性對照(健康牛組織DNA)和空白對照(無菌雙蒸水)。用1×TAE電泳緩沖液配制1.2%的瓊脂糖(含100μl/L熒光染料),在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛好沒過膠面，將5μLPCR產(chǎn)物和1μL6×Loadingbuffer混勻后加入樣品孔內(nèi)，電泳時以其PCR診斷用試劑詳見附錄D。檢查到目的條帶(電泳斑)作為診斷依據(jù)，詳見圖C.1、C.2。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10:分別為10個血液樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-5:璃眼蜱擴(kuò)增產(chǎn)物；6:陽性對照7:陰性對照(規(guī)范性附錄)D.1病原學(xué)鑒定試劑溶液的配方加800mL生理鹽水于55℃~60℃水浴中溶解，冷卻后生理鹽水定容至1L,121℃高壓滅菌15置研缽中，加50ml甘油研磨調(diào)成均勻糊狀后緩慢加入少量甲醇，研磨片刻將上層液體移入棕色試劑瓶內(nèi)，再加少量甲醇，繼續(xù)研磨，再吸出上層染液，如此連續(xù)幾次，共用甲醇1000ml。每天震蕩棕色試劑瓶內(nèi)液體(2～3)次，每次2min～3min,一周后使用效果更佳。磷酸二氫鉀(無水)0.3g磷酸氫二鈉(無水)0.23g置于燒杯中，加入少量蒸餾水溶解，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH至(6.5～6.8)后加水至1000ml。1)離心管內(nèi)加入吸200μL全血、20μL蛋白酶K和200μLBufferAL,振蕩混勻15s,56℃孵中，6000g離心1min,小心棄去濾液。3)將QIAampspincolumn與新的collectiontube組合，加500μLBufferAW1,6000g離心1min,4)將QIAampspincolumn與新的collectiontube組合，加500μLBufferAW2,18000g離心3min,小心棄去濾液。12000g離心1min去除殘留溶液。5)將QIAampspincolumn與新的1.5mL離心管放置1min,6000g離心1min洗脫DNA。2)加入700μLTris-酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1),渦旋振蕩混勻后放置10min,期間顛倒3)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入0.6倍4℃預(yù)冷的三氯甲烷-異戊醇(24:1),混勻后于-20℃下靜置5min,12000r/min離心5min。4)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入2倍CTAB沉淀液，室溫放置30min,12000r/min離5)棄上清液，加入350μLNaCl(1.2mol/L)溶解沉淀，65℃溫育10min,加入350μL三氯甲烷-異戊醇(24:1),混勻，12000r/min離心5min。6)取上清液，加入0.6倍4℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4℃放置30min,4℃下12000r/min離心5min,小心棄去上清。7)加入1mL經(jīng)4℃預(yù)冷的75%乙醇，傾斜離心管，輕輕轉(zhuǎn)動數(shù)次，4℃下12000r/min離心5min,小心棄去上清；然后用4℃預(yù)冷的75%乙醇按相同的方法重復(fù)洗一次。8)室溫下或核酸真空干燥系統(tǒng)中干燥液體，干燥后加入50μL去離子水溶解核酸，-20℃保存?；靹蚝?21℃高壓滅菌15min,-20℃保存即可。D.2.2.2TE緩沖液加水定容至1L,121℃高壓滅菌15min,4℃保存即可。EDTA(0.5mol/LpH8.0)