家畜布魯氏菌LAMP檢測(cè)方法2022-10-10發(fā)布2022-12-09實(shí)施學(xué)院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心)、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站、新對(duì)本文件的修改意見(jiàn)建議，請(qǐng)反饋至新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局(烏魯木齊市新華南路408號(hào)烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心(烏魯木齊市南湖西路15號(hào))、深圳真瑞生物科技有限公司(廣東省深圳市龍華區(qū)龍華街道清寧路1號(hào)富安娜工業(yè)園B棟5層)、新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心)(烏魯木齊市新市區(qū)冬融街726號(hào))、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站(烏魯木齊市米東區(qū)米東南路2188號(hào)紅光雅居7號(hào)公建樓)、新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話傳真郵編：830004深圳真瑞生物科技有限公司聯(lián)系電話郵編：518100新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所(新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心)聯(lián)系電話傳真郵編：830013新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳郵編：830004工家畜布魯氏菌LAMP檢測(cè)方法本文件規(guī)定了家畜布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)的生物安全措施、儀器耗材與試或使用布病疫苗免疫后的牛、羊應(yīng)在接種疫苗后12規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4生物安全措施5儀器耗材與試劑b)微量移液器(1μ~10μ,20μL～200L,200L～1000μL);e)實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增儀或熒光定量PCR儀：激發(fā)光/檢測(cè)光波長(zhǎng)分別為480/523nm。2a)0.2mL透明頂蓋PCR反應(yīng)管(適配熒光定量PCR儀)或螺帽反應(yīng)管(適配實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增c)樣品保存管(15mL、4mL);b)LAMP反應(yīng)液：含有布魯氏菌特異性檢測(cè)引物的商品化LAMP擴(kuò)增試劑；d)陽(yáng)性質(zhì)控：含有目標(biāo)核酸片段的質(zhì)粒制品(商品化試劑);e)陰性質(zhì)控：含有無(wú)關(guān)核酸序列的質(zhì)粒制品(商品化試劑)。a)恒溫震蕩儀：S1(樣本處理程序):95℃,轉(zhuǎn)速2000rpm,時(shí)間10min;S2(恒溫?cái)U(kuò)增程序):65℃,轉(zhuǎn)速0rpm,時(shí)間40min;b)實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀：擴(kuò)增溫度65℃,擴(kuò)增時(shí)間40min,每分鐘收集1次熒光。6.2.1.1母畜采集奶液或陰道拭子。每頭母畜使用2支～3支點(diǎn)斷式植絨拭子，同時(shí)塞入陰道內(nèi)，應(yīng)深插拭子，并將拭子在陰道內(nèi)輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)后取出，將拭子放入樣本保存管中折斷，蓋嚴(yán)管蓋。6.2.1.3家畜的關(guān)節(jié)腔積液、流產(chǎn)胎兒的絨毛膜水腫液、流產(chǎn)胎兒的胃內(nèi)容物也可作為檢測(cè)樣本。6.2.1.4按照NY/T541和DB65/T3893采集所需布魯氏菌病檢測(cè)樣品。采集的樣本宜當(dāng)天處理和檢測(cè)，若不能當(dāng)天檢測(cè)，應(yīng)暫放于冰箱冷藏室(4℃)保存。6.2.2.1陰道/尿道拭子：樣本保存管中加入生理鹽水1mL(此處加液應(yīng)懸空加入管內(nèi)，避免樣品之間交叉污染),蓋嚴(yán)蓋子，渦旋15s,靜置5min。小心打開(kāi)樣本保存管蓋，用移液器帶吸頭伸入管底6.2.2.2奶液、尿液：取15mL樣本放入樣品保存管中，8000rpm離心10min,棄掉上清，用生理鹽36.2.2.4采集的樣本宜當(dāng)天處理和檢測(cè)，樣本若需遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，冷藏運(yùn)輸不宜超過(guò)24h,若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)振蕩10min,程序結(jié)束后將樣本處理管置于冰盒中冰浴3min。樣本處理管冰浴后短暫離心5s,取上6.3LAMP方法檢測(cè)核酸6.3.1將LAMP反應(yīng)液置于室溫徹底融化，上下顛倒6次～6.3.2按照表1配制反應(yīng)體系。反應(yīng)體系樣本/陰/陽(yáng)性對(duì)照石蠟油注：配制反應(yīng)體系時(shí)，先配制好母液分裝到各個(gè)反應(yīng)管，再添加模母液后，再分別加入4L的擴(kuò)增模板，用巴氏吸管加兩滴石蠟油封閉反應(yīng)液，最后將PCR管的管蓋蓋a)可視法試劑(反應(yīng)液為紫羅蘭色):將反應(yīng)管置于恒溫震蕩儀孔內(nèi)(放之前確認(rèn)溫度已達(dá)到65℃),運(yùn)行程序S2,40min反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)管，肉眼觀察顏色變化，判讀并記錄檢b)熒光法試劑(反應(yīng)液為無(wú)色透明):將反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀或?qū)崟r(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)6.4.1.1可視法試劑：同批反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)后溶液顏色由紫6.4.1.2熒光法試劑：熒光定量PCR儀、實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀或便攜式熒光檢測(cè)儀上讀取結(jié)果，同批反應(yīng)的陰性質(zhì)控?zé)晒庵?lt;陰性閾值標(biāo)準(zhǔn)管熒光值；同批反應(yīng)的陽(yáng)性質(zhì)控?zé)晒庵?gt;陽(yáng)性閾值標(biāo)準(zhǔn)管熒光值，且有典型的S型擴(kuò)增曲線。46.4.2.1可視法試劑：反應(yīng)后溶液顏色變成天藍(lán)色的樣本判為布魯氏菌核酸陽(yáng)性；反應(yīng)后溶液顏色仍判為可疑，見(jiàn)圖1。a)熒光定量PCR儀或?qū)崟r(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀：樣本有典型S型擴(kuò)增曲線，且樣本熒光峰值≥陽(yáng)性閾值標(biāo)準(zhǔn)管熒光值，判為布魯氏菌核酸陽(yáng)性；樣本熒光峰值<陰性閾值標(biāo)準(zhǔn)管，判為陰性，未檢測(cè)到布魯氏菌核酸；陰性閾值標(biāo)準(zhǔn)管≤樣本的熒光峰值<陽(yáng)性閾值標(biāo)準(zhǔn)管，判為可b)便攜式熒光讀取儀：樣本的熒光值≥陽(yáng)性閾值標(biāo)準(zhǔn)管熒光值