合成生物學(xué)在細(xì)胞治療中的臨床應(yīng)用

當(dāng)前的疾病診療方式主要是依靠分析生物樣本來診斷疾病，然后

進(jìn)行化學(xué)小分子或生物大分子藥物干預(yù)，很難對(duì)病理指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)

控并實(shí)時(shí)治療。利月合成生物學(xué)方法可以為細(xì)胞設(shè)計(jì)新的功能，制備

細(xì)胞治療工具，在感應(yīng)病理指標(biāo)的同時(shí)產(chǎn)生治療作用。

合成生物學(xué)不但可以利用原核細(xì)胞通過響應(yīng)環(huán)境刺激來調(diào)控效

應(yīng)分子，還可以為真核細(xì)胞作為底盤細(xì)胞裝備生物傳感器檢測(cè)疾病靶

標(biāo)，同時(shí)激活下游信號(hào)通路。2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)CART

細(xì)胞治療藥物，成為細(xì)胞治療領(lǐng)域重要的里程碑。本文就合成生物學(xué)

在細(xì)胞治療的進(jìn)展和臨床應(yīng)用做出介紹。

一、腫瘤的細(xì)菌治療

腫瘤微環(huán)境是乏氧環(huán)境，而且具有免疫抑制性，這有利于厭氧細(xì)

菌的生長。利用厭氧菌在腫瘤微環(huán)境的富集效應(yīng)，注射厭氧菌可以在

腫瘤組織誘導(dǎo)激活免疫系統(tǒng)，免疫反應(yīng)以不依賴腫瘤抗原的方式攻擊

厭氧菌和腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤效果?？梢杂糜谀[瘤治療的細(xì)菌包括

Salmonella^Bifidobacterium、Escherichia和Clostridium等。

在一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)中,Salmonellatyphimurium(S.

typhimurium)與化療藥物聯(lián)用可以用于治療胰腺癌。為了增強(qiáng)細(xì)菌

治療的腫瘤靶向性，在細(xì)菌上表達(dá)了腫瘤特異抗原或者腫瘤特異抗

體，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤抗原依賴的細(xì)菌富集(圖1a)。

a

MetabolitesColonizationof

tumour-specific

microbiome

community}

Tumour

SensorelementAnticancer

(e.g.FF+2Opromoter)effectors

Activationofhost

Proliferationimmuneresponse

Tumour

death

AutolysisPayload

(e.g.CD47nb)

AHL-controlledContentrelease

autolysinexpression

圖1a腫瘤的細(xì)菌治療

細(xì)菌還可以遞送多種抗癌分子，并且使用腫瘤環(huán)境特異啟動(dòng)子來

驅(qū)動(dòng)抗癌基因表達(dá)，能夠?qū)崿F(xiàn)響應(yīng)腫瘤微環(huán)境釋放抗癌分子。常用的

抗癌分子包括前藥酶、siRNA等。I期臨床試驗(yàn)(NCT01562626)正

在評(píng)價(jià)表達(dá)胞喀嚏脫氨酶的Bifidobacterium對(duì)實(shí)體瘤的治療效果。

胞嘴嗦脫氨酶用于將前藥flucytosine轉(zhuǎn)化為抗腫瘤藥5-fluorouracilo

為了在腫瘤組織調(diào)控工程細(xì)菌，多種傳感器被構(gòu)建到細(xì)菌中，可以響

應(yīng)多種調(diào)控信號(hào)，如細(xì)菌密度、低氧水平和低葡萄糖濃度等。例如，

S.typhimurium經(jīng)過工程改造后可以響應(yīng)低氧環(huán)境表達(dá)溶菌蛋白

HlyE。誘導(dǎo)型細(xì)菌自溶系統(tǒng)則可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)可控的抗癌分子遞送和細(xì)

菌種群數(shù)量的穩(wěn)定。

誘導(dǎo)型自溶Escherichiacoli(E.coli)細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum

sensing)分子acyl-homoserinelactone(AHL),當(dāng)AHL處于低水平

時(shí)，細(xì)菌增殖并在胞內(nèi)產(chǎn)生抗癌分子，隨著細(xì)菌數(shù)量增加，AHL不

斷積累并超過閾值，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌裂解而釋放抗癌分子。

二、其他疾病的細(xì)菌治療

細(xì)菌治療還用于治療腸道菌群紊亂，代謝疾病和炎癥反應(yīng)疾病。

E.coliNissle1917和Lactobacillus等本身是益生菌,而且容易進(jìn)行

工程改造，可以作為細(xì)菌治療中良好的底盤細(xì)菌。高血氨癥是由于尿

素循環(huán)中酶缺陷導(dǎo)致的血液氨堆積。

E.coliNissle1917被改造可以同化氨并合成精氨酸，降低血液

氨濃度，但該方法未能通過I期臨床試驗(yàn)。苯丙酮尿癥是一種無法代

謝苯丙氨酸的代謝疾病。通過在E.coliNissle1917中表達(dá)氨基酸脫

氨酶，可以將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸從而減少氨基酸的堆積，該研

究目前已順利通過臨床I期試驗(yàn)（圖1b）。

bDefectivehostmetabolism

?Enablebiocontainmentbyremoving

dapAtogenerateadiaminopimelate

auxotroph

?Anaerobic-induciblepromoterdriving

expressionofL-Phedegradingcytosolic

andperiplasmicenzymes

E.coliNissle1917經(jīng)改造表達(dá)抗菌肽和biofilm降解酶，用于治

療銅綠假單胞菌感染（圖1c）。

DspB(biofilmdistribution)

1

PyocinS50O

r.aeruginosa(antibacterial)OO

E7lysis

protein

(releaseof

effectors)

Effectorgenes

E.coliNissleAalrAdadXexpressingLasR^.^

Quorum-sensing

molecules

圖1C細(xì)菌治療病原體感染

腸道細(xì)菌和噬菌體還被改造用于向病原菌遞送基因編輯元件，以

減少病原菌的抗藥性和毒力基因的表達(dá)（圖1d）o工程化細(xì)菌還被

用于控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá)。例如，含有siRNA質(zhì)粒的細(xì)菌

可以侵入并將質(zhì)粒遞送到腸道粘膜細(xì)胞，用于降低細(xì)胞炎性酶C0X2

的表達(dá)。

圖1d細(xì)菌提送基因

目前已有多個(gè)細(xì)菌治療系統(tǒng)處于臨床試驗(yàn)階段（表1）,但是細(xì)

菌的工程化改造也面臨挑戰(zhàn)。首先，為細(xì)菌設(shè)計(jì)合適的信號(hào)調(diào)控開關(guān)

并不容易，細(xì)菌難以響應(yīng)合適的信號(hào)閾值并產(chǎn)生適當(dāng)濃度的效應(yīng)分

子，這影響了細(xì)菌療法的治療效果。

其次，細(xì)菌治療存在生物安全性風(fēng)險(xiǎn)，歐盟和美國的藥監(jiān)部門對(duì)工程

菌的基因組穩(wěn)定性、細(xì)菌在體內(nèi)的定植時(shí)間和在體內(nèi)是否能夠被清除

等問題都要求提供大量證明。為了提高細(xì)菌治療的生物安全性，有一

系列措施用于細(xì)菌的改造，例如移除工程細(xì)菌的毒力基因來減少細(xì)菌

毒性，使用營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌或者引入自殺基因在必要時(shí)可以清除體內(nèi)

工程菌。

表1近期細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)

CIMoltnalDiSMMTreatmentormterventtonPhase

NCTO45892MMe<pancresncsneerSolmoncOary^imunumeHprvssmqrajnwiN

IL-2ancofntxnabonwttheitherFOLARINOX

orgtrnciubine

NCTonsioo;1dMtrtc5mrlbtutlocrococcuskrhsincombnatnnKhl/V

tepiizumab

NCTDI56/6Z6Adwancc<Vmcta?MkwildtonounBtfidobarttrtumlon^umcxprrswngcMaunel/l

drinwNHcinco*nmnM)onwithtiwarug

fiucytoMe?ndgrowthenhmeer10%m41tMe

NCTO416/B7MrtMtMkBidncopUtm.lymphomaFidurleMdcoilNhileenjmwredto1

expms5mGaqcntnincomtmauonwith

atcxoluiinwb

NCT04S34s42Rwny&etomriaE.ooM*s4eengineeredtomcuboliicII

Vfi*n0jUnin*

NCTOM16177r/rAUCD19CARTcdbth?c?aitcid*9m*i/a

(iC4spO)CARTceldrsmictionafter

rtmiduetd?dm<ni?ration

NCTonasinr/rQlCD10CARTcett:'armoured'wtthexpre?on1

of?naddit"MicoTimdMerygand

(4-168DthM4tK>eaprw?$ukidegcn?

(EGFRt)aBowmgCARTcdldenructwoftu

cetwunwb>dm)nKtfMion

NCTO4J779Mr/rGPCrwildtumounCFCJCARTedb*armourv<rwithrxprvsaonl

olL1SthMexpress,lutddc9ene

(iC^spO)aMowtngCARTcdldestmenon.fter

runtduridAdmimtration

NCTO421O265rAAMLr/iBALLBRDCNModuhr.un<ARTc?isincombUwoonwithl

aEombmantantibodydrbvativetM9cted

tow?dtCD12i

NCTO4631148Rcn?lcanc?t,trimrtionelcdlc4ncefoftheModular.uniCAATce*$Incomb?wKtonwtth1

renalpe+vcandurM?prostMecancct?recombinartantibodyderfvMivetargcted

nonsmal?■cancelbmi?c^ncec.towardsP5MApcpode

cdofecuicanccf

NCTO41so497次BALLAaogmcCD22CARTcdB1

rAMMAflogene?cBCMACARTcMs1

NCTDK)$61J9r/racuteandQICordblood-dertvedrwKiralbUercells3thUN

CD19CARXMR9.R.IS

NCT0?965MGbobUstoauMeMnchymtl5<?ncelbproducmgonedyoe1

adenokww

三、改造免疫細(xì)胞的細(xì)胞治療

合成生物學(xué)在T細(xì)胞治療領(lǐng)域已經(jīng)獲得了巨大成功。為模擬天然

T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用，合成的Tcellreceptor(TCR)-T細(xì)胞治療是

將識(shí)別腫瘤抗原肽的TCR構(gòu)建到殺傷性T細(xì)胞上。

TCR不但可以結(jié)合膜表面抗原，還可以結(jié)合胞內(nèi)抗原，因此可

以針對(duì)廣泛的靶點(diǎn)。TCR-T細(xì)胞治療在臨床試驗(yàn)中取得了積極的治

療效果。但是TCR只能識(shí)別抗原肽-MHC分子復(fù)合物，而MHC分

子在人群中具有多態(tài)性，這限制了TCR-T細(xì)胞治療的應(yīng)用。

為了擺脫MHC分子的限制，人工構(gòu)建了嵌合受體chimeric

antigenreceptor(CAR),CAR受體是將scFv與TCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

區(qū)域融合的人工受體，可以不依賴MHC分子識(shí)別腫瘤抗原。

第一代CAR受體只含有一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域；第二代和第三代

CAR受體包含一個(gè)或兩個(gè)共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域，可以提高T細(xì)胞的增

殖和細(xì)胞因子分泌，是目前已經(jīng)被批準(zhǔn)的CART細(xì)胞所采用的受體;

第四代CART細(xì)胞在上一代基礎(chǔ)上增加了響應(yīng)CAR信號(hào)的下游效應(yīng)

基因如細(xì)胞因子，可以提高T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間(圖2a)。

A

Tumourantigen

CAntigen-recoqnition

3aomain

Spacer

Transmembranedomain

Signallingdomains

(Icellactivation,

co-stimulation)

圖2ACART細(xì)胞治療的設(shè)計(jì)

盡管CART細(xì)胞在血液腫瘤的臨床治療中取得了成功，但是針

對(duì)實(shí)體瘤，還不能實(shí)現(xiàn)安全和有效性的治療。近年來，科學(xué)家已經(jīng)利

用合成生物學(xué)原理對(duì)CART細(xì)胞做了諸多改進(jìn)。在提高安全性方面,

以caspase9或者h(yuǎn)erpessimplexvirusthymidinekinase

（HSV-TK）作為自殺基因，利用小分子誘導(dǎo)二聚等原理激活自殺基因

作用，可以在需要時(shí)清除CART細(xì)胞（圖2Ba）。

BSafety

BaSuicidegenes

iCasp9HSV-TK

圖2Ba攜帶自殺基因的CART細(xì)胞

另外，為CART細(xì)胞構(gòu)建額外的抑制性iCAR受體可以減少對(duì)

健康細(xì)胞的攻擊抑制性iCAR是將T細(xì)胞抑制性受體CTLA4或PD1

的胞內(nèi)區(qū)與識(shí)別健康細(xì)胞抗原的scFv融合，CART細(xì)胞可以利用抑

制性iCAR受體識(shí)別健康細(xì)胞而不會(huì)產(chǎn)生殺傷激活信號(hào)，利用殺傷性

CAR受體識(shí)別腫瘤抗原（圖2Bb）。

BbInhibitoryreceptors

iCARs

圖2Bb抑制性CART細(xì)胞

減弱CART細(xì)胞的功能活性也是一種提高安全性的策略，利用

小分子誘導(dǎo)的CAR蛋白降解可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的CAR受體表達(dá)水

平，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)CART細(xì)胞活性的可逆調(diào)節(jié)（圖2Bc）。

BeExpression-levelmodulation

CARLID)-------

圖2BcCAR受體表達(dá)水平的調(diào)節(jié)

在提高有效性方面，SynNotch-gatedCAR可以實(shí)現(xiàn)“AND”邏輯

門控制殺傷，即只有兩種腫瘤抗原同時(shí)存在時(shí)才能激活腫瘤殺傷作

用。聚體原理時(shí)，第一個(gè)腫瘤抗原結(jié)合T細(xì)胞的SynNotch受體后導(dǎo)

致受體的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域從受體上被切割并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)CAR

受體的表達(dá)，CAR受體可以識(shí)別第二個(gè)腫瘤抗原產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)

（圖2Bd）。

Efficacy

圖2BdSynNotch-gatedCART細(xì)胞

AvidCART細(xì)胞是用低親和力的單域抗體替代高親和力的scFv

構(gòu)建CAR受體，這使得AvidCART細(xì)胞必須依賴兩個(gè)CAR與腫瘤

抗原結(jié)合才能激活下游信號(hào)通路，提高了對(duì)腫瘤抗原表達(dá)水平的區(qū)分

度（圖2Be）。

BeAviditytuning

AvidCARs

NoactivationActivationandActivationand

cytotoxicitycytotoxicity

圖2BeAvidCARTZ田胞

Split,universalandprogrammable(SUPRA)CARs是一種通用

的CAR受體，由TCR胞內(nèi)區(qū)和胞外leucinezipper組成，SUPRA

CART細(xì)胞發(fā)揮功能需要依賴向內(nèi)體注射適配蛋白，適配蛋白一端

為識(shí)別腫瘤抗原的scFv,另一端為互補(bǔ)的leucinezipper結(jié)構(gòu)域，

SUPRACART細(xì)胞可以根據(jù)不同的adaptor蛋白來識(shí)別不同的腫瘤

抗原(圖2Bf),在腫瘤治療的不同階段,殺傷表達(dá)不同腫瘤抗原的

腫瘤細(xì)胞，可以有效防止腫瘤細(xì)胞逃逸。

BfAntigenswitching

SUPRACARsz

圖2BfSUPRACART細(xì)胞

除了用于CART細(xì)胞治療外，CAR受體還被應(yīng)用于其他免疫細(xì)

胞。NK細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞，可以通過受體介導(dǎo)細(xì)胞殺傷。裝載了

識(shí)別腫瘤抗原受體的CAR-NK細(xì)胞在臨床I期和II期試驗(yàn)中都顯示

出了良好的治療效果（圖3a）。

而且CARNK細(xì)胞可以使用來源于HLA不配對(duì)的異體NK細(xì)胞進(jìn)行

CAR受體的表達(dá)，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明異體來源的NK細(xì)胞在病人體

內(nèi)有良好的免疫耐受，但是目前異體NK細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制還不清

楚。

aNaturalkillercells

KillsactivatedTcells

CAR-mediated

celldeath

圖3aCARNK細(xì)胞

在腫瘤微環(huán)境中，有兩種功能相反的巨噬細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞具

有抗腫瘤活性，而M2巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤生長。研究表明，CAR?

巨噬細(xì)胞可以浸潤實(shí)體瘤，通過釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫，不但可以維

持M1巨噬細(xì)胞的穩(wěn)定，還能將M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞，

Hostimmuneactivation

圖3bCAR巨噬細(xì)胞