ICS11.220B41DB14IDB14/T1804—2019前言 12縮略語 1 14實(shí)驗(yàn)條件 1 16結(jié)果判定 27注意事項(xiàng) 3附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制方法 4DB14/T1804—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山西省農(nóng)村標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山西省動物疫病預(yù)防控制中心、武漢科前生物股份有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊治平、王仲兵、郎小兵、雷宇平、董曉輝、但漢并、盧月、張仲萍、孫杰、胡明明、左曉、圖門巴雅爾、趙凱、張娟、郭永江、張昱。DB14/T1804—20191豬流行性腹瀉病毒抗體ELISA檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中豬流行性腹瀉病毒抗體方法的縮略語、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性腹瀉病毒抗體的檢測。2縮略語ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay）。OD：光密度值(opticaldensity)。HRP：辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)。3實(shí)驗(yàn)原理本標(biāo)準(zhǔn)采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（間接ELISA），該方法利用抗原抗體反應(yīng)具有特異性的特點(diǎn)，將特異性的豬流行性腹瀉病毒S蛋白包被固相載體酶標(biāo)板，加入待檢血清后，如果樣品中含有豬流行性腹瀉病毒抗體，即可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再加入羊抗豬IgG-HRP（辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體），繼續(xù)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，復(fù)合物中的酶能催化底物反應(yīng)發(fā)生顯色。其顯色的深淺與相應(yīng)的抗體量成正比，可借助OD450nm值的大小進(jìn)行定性判斷。4實(shí)驗(yàn)條件4.1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)驗(yàn)操作在15℃~25℃下進(jìn)行。未滅活的感染性材料的實(shí)驗(yàn)活動，應(yīng)在Ⅱ級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.2儀器Ⅱ級生物安全柜、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒溫箱。5實(shí)驗(yàn)方法5.1實(shí)驗(yàn)材料豬流行性腹瀉病毒S蛋白包被抗原、羊抗豬IgG-HRP、底物液、終止液、樣品稀釋液、洗滌液、包被液、封閉液。試劑配制方法見附錄A。5.2樣品準(zhǔn)備DB14/T1804—20192取動物全血，待血液充分凝固后，4000r/min離心10min，收集血清。也可等凝固后自然析出血清。血清應(yīng)清亮，無溶血。樣品處理過程中應(yīng)防止樣品的污染，注意個(gè)人安全防護(hù)。5.3包被用包被液將包被抗原稀釋至工作濃度1.5μg/mL，加至抗原包被板中，每孔100μL，2℃~8℃包被15h。5.4封閉棄去包被液，每孔加入封閉液200μL，置37℃±1℃孵育2h；棄去封閉液，拍干，再置37℃±5.5待檢血清的稀釋待檢血清在血清稀釋板中按40倍稀釋。5.6操作步驟5.6.1加樣取抗原包被板，先用洗滌液洗滌抗原包被板1次，稀釋好的待檢血清、陰性對照和陽性對照各取100μL，加至抗原包被板中，每板待檢血清設(shè)1孔，陰、陽性對照各設(shè)2孔，輕輕振勻孔中樣品，置37℃±1℃下溫育45min。5.6.2洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200μL，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。5.6.3加酶標(biāo)抗體將辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體，用封閉液1:5000稀釋，每孔加100μL，37℃±1℃放置30min。5.6.4洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200μL，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。5.6.5加底物液每個(gè)反應(yīng)孔加入底物液100μL，置20℃~25℃下避光顯色10min。5.6.6加終止液每孔加終止液50μL，10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測定450nm波長處的吸光度（OD值）。6結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件：陽性對照OD450nm值≥0.8，陰性對照OD450nm<0.25。若被檢樣品（S-N）/(P-N)≥0.2，該樣品判為豬流行性腹瀉病毒抗體陽性；若被檢樣品（S-N）/(P-N)<0.2該樣品判為豬流行性腹瀉病毒抗體陰性。DB14/T1804—20193S=樣品孔OD450nm值，N=陰性對照孔平均OD450nm值，P=陽性對照孔平均OD450nm值。7注意事項(xiàng)7.1人員防護(hù)樣品處理及實(shí)驗(yàn)過程中注意做好個(gè)人的安全防護(hù)工作。7.2樣品處理血清應(yīng)在Ⅱ級生物安全柜中析出。7.3廢棄物處理操作區(qū)應(yīng)有專門的固體和液體廢棄物收集容器，廢棄物經(jīng)高壓滅菌后按相關(guān)規(guī)定處理。DB14/T1804—20194試劑配制方法A.1包被液包被液為碳酸鹽緩沖液（0.025mol/L，pH9.6）。將下列試劑按序加入1000mL規(guī)格的容器中，加800mL蒸餾水充分溶解，定容至1000mL。碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g加蒸餾水至1000mLA.2洗滌液氯化鈉（NaCl）8.0g氯化鉀（KCl）0.2g十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸餾水至1000mLA.3底物液商品化TMB顯色液。A.4終止液98%濃硫酸（H2SO4）108.8mL加蒸餾水至1000mLA.5樣品稀釋液氯化鈉（NaCl）8.0g氯化鉀（KCl）0.2g十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g加蒸餾水至1000mLA.6封閉液牛血清白蛋白（BSA）