1、2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗一蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗,王偉中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗?zāi)康?1.加深理解所學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)性質(zhì)的理論知識2.掌握氨基酸和蛋白質(zhì)常用的定性、定量分析的方法及原理,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗原理,一、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)二、蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,一、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng),蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)是指蛋白質(zhì)所含的某些氨基酸及其特殊結(jié)構(gòu)，在一定條件下可與某些試劑發(fā)生了生成有色物質(zhì)的反應(yīng)。不同蛋白質(zhì)分子所含的氨基酸殘基不完全相同，因此所發(fā)生的成色反應(yīng)也不完全一樣。

2、呈色反應(yīng)并不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)。因此，不能僅僅根據(jù)呈色反應(yīng)的結(jié)果為陽性就來判斷被測物質(zhì)一定是蛋白質(zhì)，至少要用2種以上的方法來鑒別。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,蛋白質(zhì)呈色反應(yīng),（一）米倫氏反應(yīng)（二）雙縮脲反應(yīng)（三）蛋白黃反應(yīng)（四）茚三酮反應(yīng),2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（一）米倫氏反應(yīng),蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀，此為酪氨酸的酚核所特有的反應(yīng)，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米倫反應(yīng)。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（二）雙縮脲反應(yīng),當(dāng)尿素經(jīng)加熱至180左右時，兩分子尿素脫去

3、一分子氨，進(jìn)而縮合成一分子雙縮脲。其在堿性條件下雙縮脲與銅離子結(jié)合成紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，此類似反應(yīng)也稱蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個以上肽鍵的化合物都呈此反應(yīng)，故所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,反應(yīng)過程如下：,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（三）蛋白黃反應(yīng),在蛋白質(zhì)分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)殘基上的苯環(huán)經(jīng)硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，在堿性條件下生成物可轉(zhuǎn)變?yōu)榻埸S色的硝醌衍生物;此蛋白黃反應(yīng)（以苯酚為例）為:,2009.10-12,醫(yī)藥

4、學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（四）茚三酮反應(yīng),在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)和氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物),含有氨基的其他化合物亦可能發(fā)生此反應(yīng)。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,反應(yīng)第一步:,還原茚三酮,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,反應(yīng)第二步:,藍(lán)紫色縮合物,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,二、蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),蛋白質(zhì)是親水膠體，正常狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子表面具有水化膜和雙電層，能保持其膠體溶液的穩(wěn)定性，在一定因素的影響下，蛋白質(zhì)會失去電荷和脫水沉淀。蛋白質(zhì)的變

5、性與沉淀之間沒有必然聯(lián)系,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用（二）乙醇沉淀蛋白質(zhì)（三）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì),2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用,加鹽類如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等可以破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水膜，同時又中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，因此使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱鹽析鹽溶現(xiàn)象為低鹽濃度可使蛋白質(zhì)的溶解度增加，實(shí)驗時要加足夠量的鹽蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程，用鹽析方法沉淀蛋白質(zhì)時，較少引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析或用水稀釋時又可溶解,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院

6、生物化學(xué)實(shí)驗課件,（二）乙醇沉淀蛋白質(zhì),有機(jī)溶劑如酒精、丙酮等可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這是由于這些有機(jī)溶劑和水有較強(qiáng)的作用，破壞了蛋白質(zhì)分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀作用。若及時將蛋白質(zhì)沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質(zhì)沉淀則可重新溶解于水中。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（三）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì),溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以上時，重金屬鹽類(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)通常比較完全，故常用重金屬鹽除去液體中的蛋白質(zhì)。但應(yīng)注意，在使用某些重金屬鹽(如硫酸銅或醋酸鉛)沉淀蛋白質(zhì)時，不可過量，否則將引起沉淀再溶解。此時的溶解為

7、生成憎水膠體的緣故。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì),生物堿是植物中具有顯著生理作用的類含氮的堿性物質(zhì)。凡能使生物堿沉淀，或能與生物堿作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。如鞣酸、苦味酸和磷鎢酸等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH值低于其等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結(jié)合成性鹽而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有機(jī)酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最為靈敏而且特異。因此被用于蛋白質(zhì)的首選沉淀劑，只能沉淀蛋白質(zhì)，不能沉淀其水解產(chǎn)物，加熱可除去。,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗材料,一、實(shí)驗材料：雞卵清蛋白液，吸管（1mlx4，2mlx4，0

8、.5mlx1，5mlx2），試管（1.5x15cmx14），水浴鍋，滴管，電爐二、實(shí)驗試劑：苯酚（0.5%），米倫試劑，茚三酮（0.1%），尿素，NaOH（10%），硫酸銅（1%），硫酸銨固體，95%乙醇，NaCl，醋酸鉛，鞣酸，苦味酸，冰醋酸,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗操作,顏色反應(yīng)沉淀反應(yīng),2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,顏色反應(yīng)按下圖操作,1、米倫氏反應(yīng)：Pr+米倫試劑白色沉淀紅色2、雙縮脲反應(yīng)：3、蛋白黃反應(yīng)：Pr+34d濃HNO3觀察，再加NaOH，再觀察4、茚三酮反應(yīng)：Pr+茚三酮（0.5ml）（沸水浴）觀察顏色變化,加熱,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,沉淀反應(yīng)按下圖操作,1、鹽析：Pr+(NH4)2SO4粉末沉淀觀察2、乙醇：Pr+95%乙醇沉淀3、重金屬離子：Pr+醋酸鉛或硫酸銅沉淀4、生物堿試劑：Pr+鞣酸或苦味酸沉淀,加水,2009.10-12,醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗課件,實(shí)驗注意事項,(1).