1、,色譜分析,應用化學系,應用化學系孫敏2012.3.27,高效液相色譜,第八章高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色譜法的發(fā)展8.2反相高效液相色譜8.3正相高效液相色譜8.4離子色譜8.5離子對色譜8.6體積排阻色譜8.7疏水作用色譜8.8膠束液相色譜8.9親和作用色譜,知識要點,了解高效液相色譜的出現(xiàn)和優(yōu)點；了解高效液相色譜的分類；掌握高效液相色譜系統(tǒng)的組成部分；掌握反相色譜的含義、分離機理、固定相和流動相組成等。,8.1高效液相色譜法的發(fā)展ThedevelopmentofHPLC,8.1.1古典液相色譜8.1.2高效液相色譜的

2、出現(xiàn)8.1.3高效液相色譜的組成8.1.4高效液相色譜柱8.1.5高效液相色譜與古典相色譜、氣相色譜的比較,8.1.1古典液相色譜,液相色譜的出現(xiàn)1906年，俄國植物學家茨維特(Tsweet)用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。研究了葉綠素在100多種吸附劑上的吸附現(xiàn)象，提出了色譜法的概念。,8.1.2高效液相色譜的出現(xiàn),古典液相色譜，由于柱效低而未能發(fā)揮出潛能。氣相色譜在20世紀60年代初高速發(fā)展，但由于對高分子量的、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)不適用，人們又將注意力轉(zhuǎn)向了液相色譜。20世紀70年代，

3、液相色譜獲得了高速的發(fā)展，出現(xiàn)了高效液相色譜。高效液相色譜的特點：1)高壓、高柱效、高流速、高靈敏。2)能夠分析高沸點、熱不穩(wěn)定有機物。,1.儀器組成部分1）高壓輸液泵2）進樣系統(tǒng)3）色譜柱4）檢測器2.軟件操作系統(tǒng),8.1.3高效液相色譜的組成,Agilent1100MS,Agilent1200雙檢測,3.高效液相色譜分離過程中的兩相1）流動相作為洗脫劑2）固定相作為分離場所,8.1.4高效液相色譜柱,1.高效液相色譜柱色譜的心臟,2.色譜固定相種類多樣載體表面修飾官能團,反相色譜固定相,正相色譜固定相,陰離子色譜固定相,陽離子色譜固定相,3.高效液相色譜柱的裝填多采用“勻漿法”溶劑勻漿后氣

4、動泵高壓裝填,8.1.5高效液相與古典液相色譜、氣相色譜的比較,1.高效液相色譜和古典液相色譜的比較,2.高效液相色譜和氣相色譜的比較,第八章高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色譜法的發(fā)展8.2反相高效液相色譜8.3正相高效液相色譜8.4離子色譜8.5離子對色譜8.6體積排阻色譜8.7疏水作用色譜8.8凝膠色譜,8.2反相高效液相色譜Revised-phaseHPLC,8.2.1高效液相色譜的分類8.2.2反相色譜的含義8.2.3反相色譜的分離機理8.2.4反相色譜柱和流動相8.2.5反相色譜的應用,8.2.1高效液相色譜的分類,

5、按照分析物在固定相與流動相間作用機理的不同，主要分為9類：1、反相色譜6、親和色譜2、正相色譜7、疏水作用色譜3、離子色譜8、膠束色譜4、離子對色譜9、電色譜5、體積排阻色譜,8.2.2反相色譜的含義,1、反相高效液相色譜以強疏水性的填料作固定相，以與水混溶的有機溶劑或它們的混合物作為流動相的液相色譜。2、如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相，以極性強的水、甲醇、乙腈等作為流動相的高效液相色譜。3、反相色譜模式在HPLC中應用最廣，約占色譜應用的70%-80%，可以分離多種混合物。,8.2.3反相色譜的分離機理,1、疏溶劑理論完全或部分疏水性溶質(zhì)分子受到極性溶劑的排斥而被非極性烴類固定

6、相吸引，溶質(zhì)分子和非極性固定相之間的作用是靠弱的色散力。2、組分在兩相之間達到分配平衡時的平衡常數(shù)又稱分配系數(shù)，K=cs/cm；cs和cm分別是組分在固定相和流動相中的濃度。,3、分配系數(shù)的意義：K值的大小表明組分與固定相分子間作用力的大小。K越大，組分與固定相的親和力越大，保留時間越長，出峰速度越慢。4、分配系數(shù)的影響因素：溫度、壓力、溶質(zhì)組分的性質(zhì)、固定相和流動相的性質(zhì)。5、反相色譜中各組分如何實現(xiàn)分離?,C18反相色譜柱，分6個稠環(huán)化合物,相同色譜條件下，不同組分的分配系數(shù)的差異是實現(xiàn)色譜分離的先決條件，相差越大，越易實現(xiàn)分離。極性組分先出峰，非極性組分后出峰。,8.2.4反相色譜柱和流

7、動相,反相色譜最關鍵的部分-反相色譜柱1、目前以硅膠基質(zhì)的反相色譜柱為主1)常規(guī)硅膠鍵合C18，C8等填料柱，不利于分離堿性物質(zhì)。2)高覆蓋量的反相柱，有較強的保留。3)高穩(wěn)定性的反相柱，耐酸堿性強。4)高純硅膠反相柱，基質(zhì)純度高，金屬雜質(zhì)少，殘余硅羥基量低且酸性低，對堿性分析物的分離效果好。,2、常見的硅膠基質(zhì)反相色譜填料,碳八,碳十二,碳十八,苯基,3、其它無機氧化物基質(zhì)的反相色譜柱1）硅膠基質(zhì)反相柱缺陷：堿性流動相條件（pH8）易溶解。2）二氧化鈦、二氧化鋯或氧化鋁等無機氧化物做基質(zhì)的反相柱可以在堿性條件使用。3）缺點：比硅膠的比表面積小，固定相鍵合量低，分離能力受到限制。4）近年來，將

8、耐堿性氧化物的納米粒子自組裝到多孔硅膠表面，獲得耐堿性的無機氧化物/硅膠核殼型色譜基質(zhì)，制備了反相柱。,雜化硅膠,表面多孔層硅膠,4、聚合物基質(zhì)的反相色譜柱1）苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸酯類、聚乙烯醇類以及苯乙烯與它們的共聚物等。自身具有疏水性能夠直接作為反相色譜柱填料。在聚合物基質(zhì)上化學修飾C18，C8等烴類分子獲得反相色譜柱。2）優(yōu)點是耐酸堿，尤其適用于分離生物分子，被生物樣品污染后可以用氫氧化鈉清洗。3）缺點是耐有機溶劑差，易溶脹。,5、反相色譜的流動相1）極性溶劑或是它們的混合物例如：水（或緩沖鹽溶液）、甲醇、乙腈2）有機溶劑純度色譜純99.99%水純度要求高二次蒸餾水或多次

9、離子交換水3）常用混合流動相甲醇-水或乙腈-水，調(diào)節(jié)比例，使極性不同的組分獲得分離，極性組分先出峰，非極性組分后出峰。4）流動相中甲醇或乙腈增加，洗脫能力增強，各組分保留時間減小。,甲醇-水（80:20,V/V）,甲醇-水（85:15,V/V）,8.2.5反相色譜的應用,1、反相色譜的應用十分廣泛反相色譜是高效液相色譜最重要和最為普遍的一種模式，它的應用約占高效液相色譜的70%-80%，應用非常廣泛。2、一般小分子有機物藥物，農(nóng)藥；氨基酸，低聚核苷酸；多肽，蛋白質(zhì)等。,第八章高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色譜法的發(fā)展8.2反相

10、高效液相色譜8.3正相高效液相色譜8.4離子色譜8.5離子對色譜8.6體積排阻色譜8.7疏水作用色譜8.8凝膠色譜,8.3正相高效液相色譜Normal-phaseHPLC,8.3.1正相高效液相色譜的概念8.3.2正相色譜的固定相8.3.3正相色譜的流動相8.3.4正相色譜的分離機理8.3.5正相色譜的應用8.3.6正相色譜與反相色譜的比較,8.3.1正相高效液相色譜的概念,1.正相色譜是指以親水性的填料作為固定相，以疏水性溶劑作為流動相的液相色譜2.固定相如：硅膠、硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相3.流動相如：正己烷、正己烷-異丙醇或正己烷-乙醇,8.3.2正相高效液相色譜的固定相,1

11、、硅膠2、羥基硅膠3、氨基硅膠4、氰基硅膠,極性由小到大順序：氰基硅膠硅膠羥基硅膠氨基硅膠,8.3.3正相色譜的流動相,1、正相色譜流動相是相對于固定相極性較弱的有機溶劑或是有機溶劑的混合物。常以正己烷或環(huán)己烷做基礎溶劑，為了洗脫極性較強的溶質(zhì)，加入極性溶劑，如異丙醇、乙醇、二氯甲烷、四氫呋喃等。1)分極性弱溶質(zhì)的流動相:正己烷-異丙醇或正己烷-乙醇2)分極性強溶質(zhì)的流動相:正己烷-四氫呋喃2、正相色譜流動相要求無水，流動相中微量的水會吸附到正相固定相上，從而減弱正相柱的極性，降低分離性能；破壞色譜柱。,8.3.4正相色譜的分離機理,1、正相色譜的分離機理1）溶質(zhì)和固定相間的極性作用，如偶極-

12、偶極作用、偶極-誘導偶極作用。極性溶質(zhì)與極性固定相間存在偶極-偶極作用；弱極性或非極性溶質(zhì)如多環(huán)芳烴與極性固定相間存在偶極-誘導偶極作用。2）溶質(zhì)和固定相間的氫鍵作用、靜電作用等。2、溶質(zhì)極性越強與固定相的作用越大，保留越強，需要極性較強的流動相進行洗脫，流動相中極性組分的含量增加。,8.3.5正相色譜的應用,1、反相色譜中疏水性物質(zhì)保留太強，親水性強的物質(zhì)沒有保留，導致分離困難。2、正相色譜在極性化合物的分離方面有自己的優(yōu)勢，而且可以選擇不同極性的固定相，能夠補充反相色譜難以分離分析的物質(zhì)。3、主要應用于分離類酯化合物、甾醇類、苯甲酸酯類、脂肪酸等。,8.3.6正相色譜與反相色譜的比較,第八

13、章高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色譜法的發(fā)展8.2反相高效液相色譜8.3正相高效液相色譜8.4離子色譜8.5離子對色譜8.6體積排阻色譜8.7疏水作用色譜8.8凝膠色譜,8.4離子色譜IonHPLC,8.2.1離子色譜的概念8.2.2離子色譜的原理8.2.3離子色譜的組成8.2.4離子色譜柱8.2.5離子色譜流動相8.4.6離子色譜的應用,8.4.1離子色譜的概念,離子色譜是高效液相色譜的一種，是分析陰離子和陽離子的一種液相色譜方法。8.4.2離子色譜的原理離子色譜基本原理離子色譜的分離機理主要是離子交換樣品離子X，流動相離子

14、Y，固定相的作用位點R陽離子交換：陰離子交換：,8.4.3離子色譜的組成,1、離子色譜系統(tǒng)IC系統(tǒng)的構成與HPLC相同，由流動相傳送部分、進樣裝置、分離柱、檢測器4個部分組成，在需要抑制背景電導的情況下通常還配有抑制器。2、離子色譜的最重要的部件是離子色譜柱。,8.4.4離子色譜柱,1、陽離子色譜柱弱陽離子色譜柱離子交換基團：羧基強陽離子色譜柱離子交換基團：磺酸基2、陰離子色譜柱弱陰離子色譜柱離子交換基團：氨基強陰離子色譜柱離子交換基團：季胺3、硅膠基質(zhì)柱不耐酸堿，有機聚合物基質(zhì)柱為主，如聚苯乙烯微球修飾陰、陽離子交換基團的填料柱。,8.4.5離子色譜流動相,樣品離子的置換離子的溶液，為提高靈

15、敏度，洗脫劑中的置換離子應具有很高或很低的摩爾電導。1）陰離子交換模式中，大分子量的有機酸和它的鹽有低的電導；無機堿(OH-)有高的電導。2）陽離子交換模式中，大分子量的季銨鹽有低的電導，但強烈吸附在交換樹脂上；無機酸(H+)有高的電導。,8.4.4離子色譜的應用,離子色譜分離1）無機、有機陰陽離子；2）環(huán)境科學、生命科學、食品、工業(yè)等領域。,第八章高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色譜法的發(fā)展8.2反相高效液相色譜8.3正相高效液相色譜8.4離子色譜8.5離子對色譜8.6體積排阻色譜8.7疏水作用色譜8.8膠束液相色譜8.9親和

16、色譜,知識要點,掌握離子對、體積排阻、疏水作用、膠束液相色譜和親和色譜的含義；掌握離子對、體積排阻、疏水作用、膠束液相色譜和親和色譜的分離機理、固定相和流動相組成，以及應用對象。,8.5離子對色譜,8.5.1離子對色譜的概念8.5.2反相離子對色譜8.5.3反相離子對色譜的應用,離子對色譜的概念用正相或反相色譜柱分離離子和中性化合物混合物的方法。正相或反相系統(tǒng)分離分析離子的方法分為正相離子對色譜和反相離子對色譜。,反相離子對色譜分離過程：以反相色譜固定相如ODS作為填料，流動相為含有對離子（B-）的溶液，當樣品進入色譜柱后，樣品離子（A+）與對離子相互作用生成中性化合物（AB），在色譜固定相上

17、被保留。,流動相反相離子對色譜常用流動相是甲醇-水、乙腈-水，增加有機溶劑的含量，色譜保留減弱。在增加有機溶劑時應該考慮離子對試劑的溶解度。流動相的酸度會影響樣品離子的和對離子的解離，從而會影響保留值。表8-7反相離子對色譜流動相酸度的選擇,離子對試劑離子對試劑的種類、大小、濃度都會對分離有很大的影響。表8-8反相離子對色譜的離子對試劑反相離子對色譜的應用分離分析無機陰、陽離子，生物堿，維生素，抗菌素，藥物等，應用于生化、石油、化工等領域。,8.6體積排阻色譜,8.6.1體積排阻色譜的含義8.6.2體積排阻色譜的發(fā)展過程和應用領域8.6.3體積排阻色譜的分離機理8.6.4體積排阻色譜的固定相和

18、流動相,體積排阻色譜的含義是快速分離不同分子量混合物的色譜方法，可以給出各個組分的大概分子量及其分布。,體積排阻色譜的發(fā)展過程和應用領域20世紀60年代末Porath等使用一種低交聯(lián)度的多孔聚合物作固定相，分離了水溶性的不同分子量的聚合物，被稱作“凝膠過濾色譜（GFC）”。只適用于水溶性物質(zhì)的分離。后來出現(xiàn)了凝膠滲透色譜，用有機溶劑中溶脹性較小的多孔樹脂作為固定相，有機溶劑作為流動相測定出聚合物的分子量分布，叫作“凝膠滲透色譜（GPC）”。體積排阻色譜包括了凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜，分離原理相同，能夠快速測定高聚物分子量分布，也是分離純化蛋白質(zhì)的有用方法。,體積排阻色譜的分離機理主要依靠分子

19、的體積排阻，樣品組分與固定相之間原則上不存在相互作用，色譜柱固定相是具有不同孔徑的多孔凝膠，直徑小于凝膠孔徑的分子進入固定相中獲得保留，而直徑大于凝膠孔徑的分子僅隨流動相在固定相之間的空隙內(nèi)不在固定相中形成保留。所以大的樣品分子保留時間短，洗脫體積小；而小的分子保留時間長，洗脫體積大。圖8-8體積排阻色譜的洗脫曲線VR=V0+KSVIKS：體積排阻色譜的分配系數(shù)0-1,體積排阻色譜的固定相和流動相色譜填料的孔徑和樣品分子的大小和分布相適應，目前主要有親水性凝膠、聚苯乙烯凝膠和無機填料。流動相用緩沖溶液、可溶解聚合物的有機溶劑（如四氫呋喃）。,8.7疏水作用色譜,8.7.1疏水作用色譜的概念8.

20、7.2疏水作用色譜的分離機理8.7.3疏水作用色譜的固定相8.7.4疏水作用色譜的色譜條件,疏水作用色譜的概念1961年出現(xiàn)，1973年被正式命名。(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)利用樣品中各組分與固定相具有不同的疏水作用的性質(zhì)進行分離的方法，主要分離對象是蛋白質(zhì)。,疏水作用色譜的分離機理固定相表面為弱疏水性，比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，流動相為高離子強度的鹽溶液（高極性）。蛋白質(zhì)分子的疏水性基團和固定相的疏水基團作用而被保留。當用流動相洗脫時逐漸降低流動相的離子強度，洗脫能力增強。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先

21、流出。,疏水作用色譜的固定相（1）把排阻色譜固定相進行疏水基團的化學改性，用于疏水作用色譜固定相。（2）硅膠基質(zhì)鍵合各種弱疏水基團的固定相先鍵合親水性聚合物，再修飾上疏水基團（疏水性由弱到強：羥丙基、丙基、芐基、異丙基、苯基和戊基）鍵合聚酰胺鍵合長鏈醚鍵合聚醚（如聚乙二醇）,影響疏水作用色譜的色譜條件固定相的疏水性比反相色譜的低10-100倍流動相的離子強度離子強度越大，洗脫能力越弱，色譜保留越強酸度中性緩沖溶液溫度,8.8膠束液相色譜,8.8.1膠束液相色譜的概念8.8.2膠束液相色譜的分離機理8.8.3膠束液相色譜的表面活性劑8.8.4膠束液相色譜的應用,膠束液相色譜的概念用高于臨界膠束濃

22、度的表面活性劑溶液作為流動相，被分離溶質(zhì)在固定相和膠束相以及水相之間進行分配。膠束液相色譜的分離機理,膠束液相色譜所用表面活性劑,膠束液相色譜的應用藥物分析和環(huán)境監(jiān)測有機金屬化合物、無機陰離子、蛋白質(zhì)和藥物分子。分析痕量甲基砷酸、甲基錫、丁基錫、苯基錫等。,8.9親和液相色譜,8.9.1親和色譜的概念8.9.2親和色譜的分離機理8.9.3親和色譜的應用,生物分子能夠區(qū)分結構和性質(zhì)非常接近的其它分子，選擇性地與其中某一種特定分子相結合，這種特異性相互作用成為親和作用。包括抗體-抗原、酶-底物、激素-受體之間的特異性識別。主要還是靜電作用、氫鍵作用等。,親和色譜是一種色譜分析方法，是一種利用固定相的可逆結合特性來分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結合能力的分子，并且它們的結合是可逆的，在改變流動相條件時二者還能相互分離。親和色譜可以用來從混合物中純化或濃縮